رني بوساطة ضربة قاضية جين مزدوجة وذوقي قياس مدركات في عسل النحل (

يوضح بروتوكول الفيديو هذا تقنيات مستحدثة لإسكات جينين في آن واحد في نحل العسل البالغ، ومن ثم إجراء اختبار استجابة تمدد الخرطوم (PER) لقياس تأثير الإسكات المزدوج للجينات على الإدراك التذوقي لدى نحل العسل. يتم تحقيق ذلك من خلال تخليق حمض ريبوزي نووي مزدوج السلسلة أولاً، يستهدف جينات ثلاثة بروتينات، وهي vitelli وgenin وultras وspherical والبروتين الفلوري الأخضر.

بما أن الجين الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر GFP غير موجود في جينوم نحل العسل، فإن الحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط GFP يعمل كضابط سلبي. تتمثل الخطوة الثانية في حقن الحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط في نحل العسل باستخدام أربع استراتيجيات علاجية: الحقن بالحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط GFP وحده، وحقن مفرد بمزيج من الحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط VG وUSP، والحقن بالحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط vg في اليوم الأول يليه الحقن بالحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط USP في اليوم الثاني، والحقن بالحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط USP في اليوم الأول يليه الحقن بالحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط VG في اليوم الثاني. وبعد عمليات الحقن، تم تمييز النحل بنقاط طلاء ذات رموز لونية تتوافق مع العلاجات، ثم أُعيدت إلى الخلية.

بعد ستة أيام، يتم التحقق من تثبيط جينات VG وUSP في النحل المعالج بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (realtime PCR)، ويتم تحديد تأثير التثبيط المزدوج لجيني VG وUSP على الإدراك التذوقي من خلال اختبار PER. وفي النهاية، يتبين أن النحل الذي خضع للتثبيط المزدوج يعاني من انخفاضات ملحوظة في تعبير جينات VG وUSP وزيادات ملحوظة في الإدراك التذوقي للسكروز. يعد التدخل الذي أجريناه أداة قوية يمكننا استخدامها للكشف عن وظائف الجينات.

تُستخدم هذه الطريقة عادةً لاستهداف جين واحد. ومع ذلك، فإن الجينات هي جزء من شبكة تنظيمية معقدة. ومن إحدى الطرق التي تُمكّننا من فهم أي عملية بيولوجية بشكل أفضل هي معرفة كيفية تفاعل الجينات مع الشبكة الجينية.

للقيام بذلك، يتعين علينا التحكم في جينات متعددة في آن واحد. وحتى الآن، لم نكن قادرين إلا على تعطيل جين واحد في كل مرة في الحشرات، وهنا ولأول مرة، نريد أن نبين لكم كيفية إسكات جينين في نحل العسل بدلاً من جين واحد. يُعد منعكس تمدد خرطوم النحل (PER) تقنية مفيدة جداً لقياس الإدراك التذوقي، والذي يعد مؤشراً سلوكياً للسلوك الاجتماعي لنحل العسل.

على سبيل المثال، فإن النحل الذي يمتلك إدراكاً تذوقياً عالياً ينضج سلوكياً بشكل أسرع، ويبدأ في البحث عن الغذاء في مرحلة مبكرة من حياته، ويفضل جمع حبوب اللقاح. لبدء هذا الإجراء، قم بتصميم بادئات للحمض النووي الريبي مزدوج الشريط تستهدف الجينات المراد تثبيطها باستخدام البرنامج المجاني primer.Three. في هذه التجربة، الجينان المستهدفان للتثبيط هما vitelli, genin أو VG و ultras spherical أو USP.

بالإضافة إلى تصميم VG و USP، تم تصميم بادئات للحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة التي تستهدف جيناً ضابطاً يشفر البروتين الفلوري الأخضر، أو GFP، وهو جين غير موجود في جينوم نحل العسل. لاحقاً، تم إتمام تخليق الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة لـ VG و USP و GFP عن طريق النسخ في المختبر باستخدام نظام إنتاج RNA rib max T seven من شركة Promega.

بعد تنقية الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (double stranded RNAs) باستخدام الإجراءات القياسية، يتم إذابة كل راسب من الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة في ماء خالٍ من النوكلياز؛ ولضمان فعالية خفض تنظيم الجين، يجب أن يكون تركيز الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة حوالي 9 إلى 10 µg/µL. ولتجهيز النحل للحقن، يتم تبريد النحل حديث الظهور في ثلاجة بدرجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين. وبمجرد تثبيت النحل، يتم تثبيت ثلاث إلى أربع نحلات بشكل متوازٍ على أطباق بتري مليئة بالشمع الصلب، باستخدام دبابيس الحشرات المتقاطعة بين البطن والصدر.

قم بتبريد النحل مرة أخرى في ثلاجة بدرجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح بين دقيقة إلى دقيقتين. تأكد من أن النحل غير قادر على الحركة تماماً. يجب أن يبدو النحل في حالة ارتخاء، وليس منكمشاً أو ملتوياً.

يعد التثبيت الكامل أمراً هاماً لأن أي حركة قد تؤدي إلى زيادة حجم الجرح ورفع معدل الوفيات. أما النحل الذي يبدو منكمشاً أو ملتوياً فقد تعرض للتبريد لفترة طويلة جداً ولا ينبغي استخدامه بسبب ارتفاع نسبة الوفيات. قم بتركيب إبرة ذات قياس 30 gauge مخصصة للاستخدام مرة واحدة على حقنة Hamilton micro syringe.

املأ المحقنة بـ 3 µL من الـ RNA مزدوج السلسلة مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل المحقنة. في حال استخدام استراتيجية الحقن الواحد، تملأ المحقنة بمزيج من الـ RNA مزدوج السلسلة للجينين. أما في حال استخدام استراتيجية الحقن على مدار يومين، فتملأ المحقنة بأحد نوعي الـ RNA مزدوج السلسلة.

أدخل الإبرة في أحد جانبي البطن. ولتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية، اضغط على مكبس المحقنة ببطء للسماح بامتصاص الـ double stranded RNA. وبما أن الـ double stranded RNA لزج للغاية، فإن عملية دفعه بالكامل من المحقنة تستغرق من ثانيتين إلى ثلاث ثوانٍ.

بعد دفع المكبس لأسفل تماماً، اترك الإبرة في الجرح لمدة تتراوح من أربع إلى خمس ثوانٍ. راقب النحل لمدة من ثلاث إلى خمس ثوانٍ بعد الحقن. في حال تسربت قطرة من اللمف الدموي من الجرح، استبعد النحلة، ثم قم بتمييز منطقة الصدر في النحل بألوان مختلفة تتوافق مع المعاملات المختلفة.

في هذه المرحلة، إذا كانت استراتيجية الحقن المنفرد مستخدمة، يتم مراقبة النحل لمدة ساعة واحدة في وعاء يتوفر فيه العسل، ثم يُعاد النحل إلى المستعمرة. أما إذا كانت استراتيجية الحقن على مدار يومين هي المستخدمة، وكان قد تم حقن الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة الأول فقط، فيوضع النحل في قفص شبكي أسطواني مع توفير العسل على الجانب. يُحفظ النحل في حاضنة عند درجة حرارة 34 °C ورطوبة 80% طوال الليل وحتى اليوم التالي.

احقن نفس النحل بـ RNA مزدوج السلسلة الثاني، باتباع نفس الإجراء المستخدم مع RNA مزدوج السلسلة الأول. اترك النحل ليتعافى في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في وعاء يحتوي على عسل، ثم أدخله في الخلية. بعد ستة أيام من الحقن، اجمع النحل المعالج من الخلية دون استخدام المدخنة لفتح الخلية.

لا يُستخدم الدخان لأنه قد يؤثر على الإدراك التذوقي للنحل، وهو ما سيتم اختباره في هذا الإجراء. اجمع النحل في أقفاص أسطوانية من الشبكة المعدنية باستخدام ملاقط ناعمة، على ألا يتجاوز عدد النحل ثلاث نحلات في كل قفص لتثبيت النحل في مقايسة PER.

يتم تبريد النحل عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم شل حركتها تماماً. يتم تثبيت كل نحلة رأسياً داخل أنبوب بلاستيكي مصمم خصيصاً لتقنية PER. استخدم شريطاً لاصقاً لتثبيت البطن داخل الأنبوب مع إبقاء الرأس بارزاً خارج الأنبوب.

ضع الأنابيب على حامل يحتوي على صفين من الأعمدة البلاستيكية الصغيرة. يتم ترقيم أحد الصفين حتى يمكن تخصيص رقم تعريف للنحل المثبت. ضع الحوامل التي تحتوي على النحل المعالج في حاضنة عند درجة حرارة 34 °C ورطوبة 80% لمدة ساعتين أثناء فترة حضانة النحل.

قم بتحضير سلسلة من محاليل السكروز والماء. ثم قم بتعبئة هذه المحاليل في محاقن مزودة بإبر قياس 15 إلى 20 لإجراء مقايسة PER.

يتم اختبار النحل في مجموعات. أولاً، قم بلمس قرن استشعار كل نحلة بقطرة من محلول بتركيز 0%، وهو الماء، وبعد ذلك يتم الاختبار بمحاليل سكروز بتركيزات 0.1% و0.3% و1% و3% و10% و30%. مع ترك فاصل زمني لا يقل عن دقيقتين بين كل محلول مائي والآخر.

عادةً ما يستغرق اختبار 20 نحلة باستخدام تركيز واحد من السكروز حوالي دقيقتين. لذا، يجب أن يكون هناك دائمًا أكثر من 20 نحلة في كل مجموعة. إذا قامت النحلة ببسط خرطومها بالكامل، يتم احتساب ذلك كاستجابة إيجابية. في الوقت الفعلي.

أكد تحليل PCR أن استراتيجيتي الحقن لمرة واحدة والحقن على مدار يومين أديتا إلى خفض مستويات نسخ Fiji و USP بشكل ملحوظ في نحل العسل. في هذه الرسوم البيانية، وبعد مرور ستة أيام من حقن الـ RNA مزدوج الشريط، يشير RQ إلى مستوى القياس الكمي النسبي لنسخ الجينات المستهدفة، وتدل الحروف المختلفة الموجودة فوق الأعمدة على وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات المعالجة. وكشف تحليل ما بعد الاختبار أن تثبيط نسخ USP باستخدام الحقن لمرة واحدة بمزيج من الـ RNA مزدوج الشريط والحقن على مدار يومين (بحقن VG أولاً ثم USP ثانياً) كان أقل بكثير من الحقن على مدار يومين (بحقن USP أولاً ثم VG ثانياً).

يشير هذا إلى أن VG قد يكون منظمًا أساسيًا في الحلقة التنظيمية بين VG وهرمون الشباب. تم حساب درجات استجابة GUA أو GRS للنحل المعالج من نتائج استجابة تمدد الخرطوم أو مقايسة PER كما هو موضح هنا. كانت قيمة GRS في النحل الذي تم حقنه بخليط من الحمض النووي الريبوزي مزدوج الشريط لـ VG و USP أعلى بكثير من قيمة GRS في نحل التحكم GFP، مما يشير إلى أن النحل الذي خضع لعملية تثبيط مزدوج كان أكثر حساسية للسكروز.

تشير الحروف المختلفة الموجودة فوق الأعمدة إلى وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات المعالجة. يظهر هنا شبكة تنظيمية محتملة بين vi genin ultras و spherical و juvenile hormone تم الكشف عنها من خلال التثبيط المتزامن لجينات VG و USP. وبينما لا يؤدي التثبيط الفردي لـ USP إلى أي تغيير في juvenile hormone، فإن التثبيط المزدوج لـ VG و USP يتسبب في زيادة أكبر في juvenile hormone مقارنة بالتثبيط الفردي لـ VG.

يشير هذا إلى أن vitelli لا يثبط إنتاج هرمون الشباب فحسب، بل يثبط أيضاً استجابة التغذية الراجعة لهرمون الشباب تجاه تعطيل USP. وفي حالات التعطيل المزدوج، ينتج الارتفاع الملحوظ في إنتاج هرمون الشباب عن انخفاض التثبيط الناتج عن VI genin بسبب تعطيل VG، واستجابة تعويضية لانخفاض نقل هرمون الشباب الناجم عن تعطيل USP. ويمكن العثور على مناقشة أكثر تفصيلاً لهذه الشبكة التنظيمية في نص البروتوكول المرفق.

من خلال استخدام نهج تثبيط الجينات المزدوج، كشفنا عن علاقة مفصلة بين الجينات الحيوية، وultras، وspherical، وهرمون الشباب، وهي علاقة لم نكن لنكتشفها من خلال تثبيط جين واحد فقط. والآن، وباستخدام هذه التقنية، يمكن للباحثين استكشاف الترابط بين الجينات ضمن الشبكات التنظيمية. وتُعد استجابة رفض التغذية (PR) طريقة قياسية تستخدم لقياس الإدراك التذوقي في نحل العسل، ومع ذلك، فإنها حساسة للغاية لعمليات المناولة، لذا يجب توخي الحذر الشديد للحفاظ على الاتساق بين البيئة وطريقة التعامل مع الحيوانات.

بالإضافة إلى ذلك، إذا كان سيتم إجراء المقايسة على مدار عدة أيام، فمن المستحسن الاحتفاظ بجدول زمني موجز والمراقبة لضمان عدم تغير الظروف الجوية والبيئية.