إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير بروتينات كبيرة متعددة الوحدات (oligomeric) مرتبطة بالـ DNA مثل MGM 1 0 1 باستخدام استراتيجية وسم بروتين ربط المالتوز (MBP). يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استنساخ إطار القراءة المفتوح لـ MGM 1 0 1 في اتجاه المصب من MBP في ناقل PMLC two E للتعبير عنه في بكتيريا e coli. بعد ذلك، يتم تنقية البروتين الاندماجي M-V-P-M-G-M 1 0 1 من بكتيريا e coli بواسطة كروماتوغرافيا الألفة (Affinity chromatography) من نوع AMLO.

بعد ذلك، يتم تحرير MGM 1 0 1 من MVP عن طريق الانشطار البروتيني (Proteolytic Cleavage) وفصله عن MVP باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني. وأخيراً، يتم تنقية حلقات MGM 1 0 1 حتى التجانس باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. وفي النهاية، يتم الحصول على 0.8 مليجرام تقريباً من MGM 1 0 1 الذائب.

يمكن استخدام لتر واحد من المزرعة البكتيرية للتوصيف الكيميائي الحيوي والتركيبي لهذا البروتين، والذي يلعب دوراً هاماً في إصلاح DNA في الميتوكوندريا. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام نسخة من MGM 1 0 1 موسومة ببروتين رابط ميتالي في كون هذه النسخة أقل سمية، وأكثر ذوباناً، وأكثر استقراراً من النسخة غير الموسومة. ونتيجة لذلك، يمكننا الحصول على مستوى تعبير عالٍ من بروتين MGM 1 0 1 الأصلي في e coli.

مرحباً، اسمي سارة فيكي، وأنا أخصائية دعم أبحاث أولى في مختبر الدكتور Jji TEN هنا في جامعة SUNY Upstate Medical University. سأقوم أنا وزميلي وانغ وونغ الآن بشرح عملية تعبير وتنقية MGM 1 0 1. ابدأ في إنتاج البروتين الاندماجي باستخدام تقنية PCR لتضخيم تسلسل التغليف الناضج لـ MGM 1 0 1.

لا تُدرِج أول 22 بقايا حمض أميني طرفية من MGM 1 0 1، والمعروف أنها تُقطع. بعد الاستيراد إلى الميتوكوندريا، يتم وضع MGM 1 0 1 المُضخّم بعد تسلسل MAL E، الذي يشفر بروتين ربط المالتوز أو MVP في نسخة معدلة من ناقل التعبير PM MAL C two E. ينتج عن ذلك اندماج M-V-P-M-G-M 1 0 1 مع رابط يحتوي على موقع قطع للبروتياز الدقيق. يتم بناء البلازميد أولاً عن طريق اختيار محولات e coli بدون استخدام نظام الاختيار الأزرق والأبيض.

يتم بعد ذلك إدخال البلازميد الناتج PLC two E, MGM 1 0 1 في سلالة e coli، وهي BL two one codon plus DE three RIL، وتُنمى على أطباق LB التي تحتوي على ampicillin و chloramphenicol. ابدأ بتلقيح 10 milliliters من وسط LB المكمل الطازج بمتحولات e coli، مع التحضين عند 37 degrees Celsius طوال الليل مع الرج بسرعة 200 RPM. وفي اليوم التالي، يتم تلقيح لترين من وسط LB المكمل باستخدام 10 milliliters من المزرعة الأولية.

قم بتنمية الخلايا عند 37 درجة مئوية مع الرج. وعندما تصل قيمة OD 600 إلى 0.5، قم بتحفيز تعبير بروتين الاندماج M-B-P-M-G-M 1 0 1 عن طريق إضافة IPTG بتركيز نهائي قدره 0.3 Millimolar، ثم قم بتنمية الخلايا مع الرج عند 30 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. وبعد مرور خمس ساعات، انقل المزارع إلى زجاجات طرد مركزي سعة 500 milliliter واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد التخلص من الطافي، أضف 30 milliliters من محلول التحلل (lysis buffer) الذي يحتوي على مثبطات البروتياز، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا عن طريق السحب والضخ باستخدام الماصة. بعد ذلك، قم بمعالجة معلق الخلايا بالموجات فوق الصوتية على الثلج لمدة 20 seconds. باستخدام معالج الموجات فوق الصوتية بدورة تشغيل 50%، اترك الخلايا لتبرد على الثلج لمدة 30 seconds.

بعد ذلك، كرر خطوتي المعالجة بالموجات فوق الصوتية والتبريد مرتين إضافيتين. مع إبقاء المعلق على الثلج، أضف 1 mL من محلول بتركيز 2 mg/mL.

قم برجّ المخزون الواحد من الحمض النووي DNA مع محلول التحلل الخلوي عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين. بعد مرور ساعتين، اضبط التركيز النهائي للملح ليكون 500 millimolar عن طريق إضافة 4 mL من كلوريد الصوديوم بتركيز 5 M إلى 36 mL من محلول التحلل الخلوي.

بعد ذلك، ولإزالة حطام الخلايا، يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 10,000 ×g في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم يُنقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. وفي هذه المرحلة، يمكن استخدام جزء قدره 20 µL لمراقبة كفاءة التحلل باستخدام الموجات فوق الصوتية.

على هلام SDS-PAGE. بعد ذلك، يتم تمرير مستخلص الخلايا عبر عمود أميلوز. لتنقية البروتين الاندماجي MVP MGM 1 0 1، ابدأ بإضافة 1.5 milliliters من معلق بتركيز 50% من راتنج AMLO إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، ولتحقيق التوازن، أضف 13 milliliters من lysis buffer، ثم قم بالطرد المركزي عند 2000 ×g لمدة خمس دقائق. كرر عملية الغسل هذه أربع مرات إضافية، ثم أعد تعليق الراتنج في 0.75 milliliters من lysis buffer. أضف ملاط AMLO المتوازن إلى محلول تحلل الخلايا وقم برجّه بلطف عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

في اليوم التالي، يتم تحميل مزيج راتنج الأميلوز مع المستخلص البروتيني على عمود كروماتوغرافيا من نوع econo مثبت في غرفة باردة. افتح صنبور الإيقاف للسماح للبروتينات غير المرتبطة بالمرور إلى أنبوب تجميع عبر الترشيح بالجاذبية. بعد ذلك، اغسل راتنج AMLO بإضافة 300 milliliters من محلول الغسيل المنظم الأول.

بمجرد مروره بالكامل، كرر عملية الغسل باستخدام 150 milliliters من محلول الغسل المنظم الثاني. بعد إضافة محلول الاستخلاص (Elution buffer) وجمع كسر الاستخلاص (EIT) كما هو موضح في البروتوكول النصي، حدد كمية ونقاوة M-V-P-M-G-M 1 0 1 عن طريق تحميل جزء من كسر الاستخلاص (EIT) على هلام SDS-PAGE.

بعد تشغيل الهلام، قم بإجراء صبغ Coomassie، حيث يجب أن تظهر حزمة واحدة رئيسية تبلغ كتلتها حوالي 70 kilodaltons. أضف 50 units من precision protease إلى M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs وضعها في أنبوب دياليز مع dialysis buffer. اترك عملية القطع تستمر طوال الليل عند درجة حرارة أربع degrees Celsius.

قم بتشغيل هلام SDS page كما في السابق. ولتقييم كفاءة الانقسام، يجب أن يؤدي الانقسام الكامل إلى ظهور حزمتين بوزن 42 و 28 kilodaltons، واللتين تتوافقان مع MVP و MGM 1 0 1 على التوالي. قم بتحميل MVP MGM 1 0 1 المنقسم عن طريق حقنات متعددة على خرطوشة bio scale mini macro prep high S متصلة بنظام BioRad biologic DUO flow FPLC.

ابدأ عملية كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني بتطبيق تدرج ملحي متدرج من كلوريد الصوديوم بتركيزات 5 millimolar، و300 millimolar، و500 millimolar، و750 millimolar، و1000 millimolar. يتم تحضير هذا التدرج عن طريق خلط المنظم A والمنظم B. اضبط معدل التدفق عند 0.5 milliliters per minute. اجمع أجزاء بحجم 2 milliliters في جامع الأجزاء، وعادة ما يتم شطف MGM 1 0 1 عند تركيز ملحي قدره 500 millimolar.

اجمع الكسور الخاصة بقمة MGM 1 0 1 وتحقق من نقاء البروتين باستخدام هلام SDS page. يجب أن تظهر قمة MGM 1 0 1 حزمة واحدة تبلغ حوالي 28 kilodaltons بعد جمع كسور البروتين من كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني وديلزة البروتين في محلول GF equilibration buffer عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد ذلك، انقل البروتين إلى عمود ترشيح Aveva spin 15 R ultra filtration spin column وقم بالطرد المركزي عند 3000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لتركيز البروتين.

بمجرد تقليل الحجم إلى حوالي 1 mL، يتم تحميل MGM 1 0 1 على عمود supra six prep grade مُعاير ومتوازن مع منظم الكروماتوغرافيا، ثم تبدأ عملية استبعاد الحجم باستخدام منظم الكروماتوغرافيا بمعدل تدفق قدره 0.5 mL في الدقيقة. تخرج البروتينات قليلة القسيمات (oligomeric) الكبيرة في الكسور الأولى، بينما تخرج البروتينات الصغيرة في الكسور المتأخرة. وتخرج حلقات MGM 1 0 1 عند وزن جزيئي يبلغ حوالي 400 Kilodaltons.

قم بجمع أجزاء قمم MGM 1 0 1 المنقاة باستخدام جامع الأجزاء، ثم قم بتحميل كميات صغيرة من هذه الأجزاء على هلام SDS-PAGE بتركيز 12% للتحقق من الجودة النهائية للبروتين. بعد ذلك، قم بتركيز البروتين باستخدام Aveva. قم بالدوران ست مرات عن طريق الطرد المركزي عند 3000 ×g في درجة حرارة 4 °C.

ثم قم بالتجميد السريع للأجزاء البروتينية في أنابيب طرد مركزي دقيقة عن طريق غمرها في النيتروجين السائل لمدة دقيقتين. تُخزن العينات عند درجة حرارة 80- °C لمدة تتراوح بين 6 إلى 12 شهراً. تُستخدم عينات MGM 1 0 1 في مقايسة الارتباط بالـ DNA أحادي السلسلة وفي التصور البنيوي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ.

تُظهر نتائج مقايسة إزاحة الحركية الكهربائية أن بروتين MGM 1 0 1 المنقى يتمتع بنشاط ارتباط قوي بالحمض النووي DNA أحادي السلسلة. حيث يتم احتجاز مسبار DNA أحادي السلسلة بشكل متزايد في آبار هلام بولي أكريلاميد طبيعي بواسطة MGM 1 0 1 قليلي القسيمات.

عندما يتم إضافة M GM 1 0 1 بتركيز أعلى من 400 nanomolar. تُظهر هذه الصور المجهرية الإلكترونية التنظيم البنائي عالي الرتبة لـ MGM 1 0 1. يتواجد M GM 1 0 1 المُحضّر حديثاً على شكل حلقات متميزة بقطر 20 nanometers، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ باستخدام الصبغة السلبية.

بعد عدة أسابيع من التخزين عند درجة حرارة 4 °C، يشكل MGM 1 0 1 خيوطاً حلزونية فوق جزيئية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أسبوع واحد.

شكراً للمشاهدة.