Name: المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين في المختبر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: تعلم معايرة الجليكوجين الكيميائية الحيوية في المختبر باستخدام تحليل الفلورسنت. تُستخدم هذه الطريقة لقياس مستويات الجليكوجين بدقة في العينات الخلوية ودراسة عمليات التمثيل الغذائي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن ممتنون إلى الدكتور تييري Pourcher على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام مطياف مضان ومساعدته. ويتم تمويل المختبر من قبل الدوري الفرنسي الوطني كونتر جنيه السرطان (فريق الرياضي labellisée)، وجمعية بحوث صب لا مناهضة جنيه السرطان، والمعهد الوطني للسرطان (إنكا)، والوكالة الوطنية صب لا بحوث، METOXIA (برنامج الاتحاد الأوروبي FP7)، والمركز A. Lacassagne، والمركز الوطني للبحوث العلميه، والمعهد الوطني للسانتيه آخرون دي لا بحوث ميديكال وجامعة نيس ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). نشكر الدكتور كريستيان M الإبراهيمي في القرن لقراءة نقدية وتصحيح التحرير.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين 1. تحلل الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور بتركيز 0.5-2 × 10 6 لكل 100 ملم طبق القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج: احتضان خلايا 24، 48، أو 72 ساعة في تركيز الأكسجين المنخفض (نقص الأكسجين) في علة بوكس محطة العمل اللاهوائية (Ruskinn تكنولوجيا Biotrace الدولية بي، كارديف، المملكة المتحدة) وضعت في 1٪ أو 0.1٪ O 2، 94٪ أو 94.9٪ N 2، و 5٪ CO 2. في موازاة ذلك، احتضان الخلايا في normoxia (21٪ O 2، 5٪ CO 2). تغيير المتوسطة (25 ملي المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز) كل 24 ساعة لتقليل الاختلافات في تركيز الجلوكوز خلال فترة التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج، وخلايا غسل 2X مع برنامج تلفزيوني لإزالة آثار الجلوكوز من مستنبت. تتخلص من الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الحل في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. بيليه يمكن تجميد في -20 درجة مئوية قبل المضي قدما.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. إضافة 100 ميكرولتر من الجليكوجين المخزن المائي المتوفرة مع الفحص كيت الجليكوجين (Abcam). غلي المحللة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل الإنزيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأجهزة الطرد المركزي في دوامة المحللة في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة لإزالة منتجات غير قابلة للذوبان. إبقاء طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتطبيع مستويات الجليكوجين لمحتوى البروتين بين العينات، التقدير الكمي للبروتينات يمكن القيام به مع 25-35 ميكرولتر من طاف باستخدام مقايسة حمض Bicinchoninic (BCA-Interchim). </li></ol> بعض المحللة يمكن استخدامها لقياس تركيز الجلوكوز داخل الخلايا الحرة. 2. التحلل من الجليكوجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 50 ميكرولتر من طاف (الخطوة 1) مع 1 ميكرولتر من التحلل أنزيم ميكس. يحتوي هذا الخليط غلوكوأميلاز. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منحنى المعايرة عن طريق تمييع الجليكوجين القياسية (2 ملغ / مل) قupplied مع عدة لإيجاد حل من 10 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت التحلل. المقبل، وإعداد ستة أنابيب منفصلة مع 0، 4، 8، 12، 16، و 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل القياسية وضبط كل أنبوب إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر مع العازلة المائي لإعطاء تركيز الجليكوجين 0، 0.04 ، 0.08، 0.12، 0.16، و 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة 1 ميكرولتر من أنزيم ميكس التحلل في المعايير واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> يجب أن تطرح تركيز الجلوكوز خلفية خط الخلية، التي قدمها قيمة للتركيز الجلوكوز الحرة، من قيمة للتركيز الجلوكوز الإجمالي (الجلوكوز من الجليكوجين التحلل + خالية من الجلوكوز) لتحديد مستوى الجليكوجين في الخلية. 3. التنمية والقراءة من الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل حالة، وإعداد أنبوب واحد (أنبوب 1) لقياس تركيز السكر الحر واثنين من أنابيب (أنابيب 2 و 3) لقياس مجموع تركيز الجلوكوز (كل الطرافة أنبوبها حجم مختلفة من الجليكوجين تحلل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من طاف المستخرجة في نهاية الخطوة 1 في أنبوب 1. إضافة 35 ميكرولتر من العازلة المائي لإتمام إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. سوف مضان الحصول إعطاء تركيز الجلوكوز الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2) في أنبوب 2. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. حجم العينة (X ميكرولتر) لابد من تعديلها وفقا لكثافة الخلية و / أو نوع من الخلايا من أجل الحصول على القيم مضان التي لا تتجاوز تركيزات من منحنى المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل في أنبوب 3. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول التنمية للعينات والمعايير عن طريق خلط لكل أنبوب 48.7 ميكرولتر من العازلة التنمية، 1 ميكرولتر من التنمية أنزيم ميكس و 0.3 ميكرولتر من OxiRed دقق (مرفق في الجليكوجين الفحص كيت). على سبيل المثال، لمدة 2 الظروف، وإعداد المزيج لمدة 12 أنبوبق (6 لمعايير، 2 للجلوكوز حرة و 4 لمجموع مضان الجلوكوز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من هذا المزيج إلى كل أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان في الطول الموجي من 535 نانومتر الإثارة، والطول الموجي من 587 نانومتر الانبعاثات على النحو الموصى به، وفتحة من 3 نانومتر لالإثارة وانبعاث. </li></ol>

<ol><li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li>
<li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li>
<li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li>
<li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+liver+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li>
<li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li>
<li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li>
<li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Fluorescent+glycogen%22+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li>
<li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DCH+%22Theory+and+practice+of+histotechnology%22">Theory and practice of histotechnology</a>. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).</li>
<li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Kokubyo+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين في المختبر يسمح الكمي الدقيق للخلايا محتوى الجليكوجين. مقارنة مع بعض التقنيات الأخرى (PAS، المناعي مع الأجسام المضادة الجليكوجين، الخ)، وهذه المعايرة هي محددة جدا وحساسة وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة مريحة نظرا لأنه لا يتطلب أي نشاط إشعاعي ولكن مطياف مضان. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو كمية بحتة ولا يوفر المعلومات حول توزيع الجليكوجين في الخلية. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt...

الجليكوجين هو بوليمر multibranched من بقايا الجلوكوز، والتي هي موجودة في السيتوبلازم العديد من أنواع الخلايا. وهي واحدة من أهم أشكال تخزين الطاقة في الخلايا ويلعب دورا هاما في أيض الجلوكوز. معظم خلايا الثدييات هي قادرة على انتاج وتخزين الجليكوجين، والتي يمكن أن يتحلل سريعا إلى جلوكوز لتعزيز إنتاج وتحلل ATP أثناء الإجهاد الأيضي. خلايا الكبد تنتج كميات هائلة من الجليكوجين لتنظيم مستوى السكر في الدم وبالتالي توفير امدادات مستمرة من الجلوكوز في الجسم. في المقابل، فإن تركيز الجليكوجين في خلايا أخرى (العضلات، وخلايا الدم الحمراء، الخ) منخفضة نسبيا. ومع ذلك، محليا، وهذه الكميات كافية لتوفير الطاقة على المدى القصير عند فجأة تتعرض الخلايا لبيئة المحرومين من المواد المغذية. توليف الجليكوجين والجليكوجين انهيار يتبع نفس الخطوات في جميع الأنسجة (الشكل 1). أولا، الجلوكوزيدخل الخلايا عن طريق ناقلات الجلوكوز (افراط)، ويتم تحويلها بسرعة من الجلوكوز 6 فوسفات (G6P) إلى جلوكوز-1-الفوسفات (G1P) من خلال فسفوغلوكوموتاز. ثم يتم تعديل G1P الى UDP الجلوكوز، ويتم إرفاق C1 الكربون من UDP الجلوكوز إلى بقايا التيروزين من glycogenin، البروتين رسو الجليكوجين. هذا الجزيء، يعتبر التمهيدي الجليكوجين، تم تمديده عن طريق الحجز من UDP الجلوكوز إلى جلوكوز عن طريق محطة α (1 → 4) السندات عن طريق سينسيز الجليكوجين. أخيرا، عندما يتم تشكيل سلسلة خطية من أكثر من 11 بقايا الجلوكوز، انزيم المتفرعة نقل وقليل السكاريد محطة مكونة من ما لا يقل عن 6 إلى بقايا الجلوكوز الجلوكوز آخر من سلسلة المجاورة من خلال α (1 → 6) الربط. تكرار هذه العملية يعطي هيكل كسورية ضخمة تحتوي على الفروع التي تشكل الحلزون مع 6.5 الجلوكوز في المقابل. الجليكوجين يمكن أن يكون باتجاهين معاكسين تحلل إلى جلوكوز عن طريق العمل المتضافرمن المشذب الانزيمات التي يتحلل لα (1 → 6) ملزمة والجليكوجين فسفوريلاز أن hydrolyzes وα (1 → 4) غليكوزيدية المربوطة بين بقايا الماضي من الجلوكوز من فرع وجزيء الجليكوجين. يتم تنشيط هذا التفاعل يسمى تحلل الغليكوجين من خلال زيادة مستويات AMP (التي تعكس استهلاك ATP)، وتحول دون الجلوكوز وATP 2،3. بواسطة المجهر الإلكتروني، وقد وصفت جزيئات الجليكوجين في العديد من أنواع الخلايا جزيئات β كما حرة (أو monoparticles الجليكوجين) من 15-30 نانومتر في القطر. في أنواع معينة من الخلايا مثل خلايا الكبد، والجسيمات β يمكن تجميعها في مجمع لتشكيل ريدات، والمعروف أيضا باسم جسيمات α التي تختلف في القطر من 80 نانومتر إلى حد أقصى قدره 200 نانومتر 4 </سوب&gt;. الطريق مستعبدين هذه الجسيمات β لتشكيل مجموعات أكبر من الجسيمات α لا يزال غير توضيح بالكامل. يميل بعض الأدلة لإثبات أن الجزيئات β يمكن المستعبدين من قبل الرابطة التساهمية 5، الرابطة الهيدروجينية، أو حتى من خلال تفاعلات البروتين البروتين 6. كمية الجليكوجين المخزن في الخلايا يعتمد على الكثير من العوامل: (I) كمية glycogenin في الخلية التي يبدأ تخليق الجليكوجين، (الثاني) نشاط سينسيز الجليكوجين وفسفوريلاز ينظمها البروتين الفسفرة / نزع الفسفات، (الثالث) تركيز الجلوكوز في الخلايا، والتي تعتمد على عدة معايير مثل توريد الجلوكوز من الأوعية الدموية وامتصاص الجلوكوز من قبل الخلايا. وينظم مخازن الجليكوجين بإحكام من قبل تنظيم تفارغي الهرمونات السكروز من خلال نواتج وسيطة، من خلال الهرمونات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي والطاقة، والمواد الغذائية الاستشعار عن مسارات إشارات 7. من المهم أن تكونقادرة على تحديد الجليكوجين في العينات البيولوجية إلى فهم أفضل لأهمية التمثيل الغذائي الجليكوجين في الجسم كله والمستوى الخلوي. نحن هنا وصف دقيق البيوكيميائية، واستنساخه ومريحة في فحص المختبر لالجليكوجين. ويستند هذا الأسلوب على مضان الجلوكوز الكمي قبل وبعد التحلل محددة من الجليكوجين. توجد طرق أخرى لتقدير مستوى الجليكوجين في الخلايا، ولكن معظمهم ليسوا الكمي. واستند واحدة من التقنيات أول وصف لتقدير حجم الجليكوجين في الخلايا على قياس التأسيس [14 C] الجلوكوز في الجليكوجين 8،9. استخدام النشاط الإشعاعي يجعل هذه العملية أكثر صعوبة في التعامل معها ولكن له ميزة توفير نسبة الجلوكوز إلى الجليكوجين التأسيس والتمييز بين توزيع بقايا الجلوكوز على الفروع والخارجي في قلب جزيء (فإنه يتطلب أيضا β-amyloly إضافيةجهاز الأمن والمخابرات وخطوة الكروماتوغرافي). وقد تم تطوير تقنية أخرى في الآونة الأخيرة ويقوم على دمج 2-NBDG (2 - {N-[7 nitrobenz-2-oxa-1 ،3-diazol-4-YL]} الأمينية-2-deoxyglucose)، و 2-deoxyglucose مشتقة الفلورسنت، في الجليكوجين 10. قياس كثافة مضان يعكس كمية الجليكوجين إنتاجها ويمكن قياس مع قارئ مضان. ويمكن أيضا توزيع مضان في الخلية يتم تقييمها بواسطة المجهر متحد البؤر. من بين التقنيات الأخرى nonquantitative، الدوري حمض شيف تلطيخ (PAS) وربما كان الأكثر شيوعا. ويمكن استخدامه للكشف عن الجليكوجين في خلايا ثابتة، أقسام الأنسجة في البارافين أو المجمدة. هذه الألوان تقنية النسيجية تحديدا غير السكريات، السكرية، البروتينات السكرية، والسليلوز mucins محايد باللون الأرجواني. ويمكن زيادة خصوصية هذا الاختبار عن طريق العلاج من خلايا ثابتة أو أقسام الأنسجة مع دياستاز، الذي يساعد على هضم تحديدا الجليكوجين. بعد ذلك،مستوى الجليكوجين يمكن تقدير نوعيا من خلال مقارنة عينات unhydrolyzed (جميع الجزيئات الكربوهيدرات تعديل) لعينات تحلل (الكربوهيدرات تعديل الجزيئات باستثناء الجليكوجين). يوفر تلطيخ PAS والتحليل المجهري، على عكس فحوصات البيوكيميائية من الجليكوجين، معلومات بشأن توزيع الجليكوجين في الخلية، والتي يمكن أن تنتشر أو تتركز في جزء معين من الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الاختلافات في التقديرات PAS تلطيخ تراكم الجليكوجين بين ظروف مختلفة، فإنه ليس الكمي 11. والأضداد وحيدة النسيلة الماوس في الأصل باستخدام الفك السفلي اللقمة الغضروف كما ثبت مستضد لتتفاعل مع الجليكوجين في الخلايا وتنقيته مع الجليكوجين في المختبر 12. كما تعترف هذه الأجسام المضادة على وجه التحديد سلاسل السكر المرتبطة الجليكوجين، بل هو أداة مفيدة للكشف عن الجليكوجين عن طريق المناعية بطريقة أكثر تحديدا من تلطيخ PAS. </p&gt; المجهر الإلكتروني هو أسلوب آخر أن يسمح التصور من الحبوب من الجليكوجين في الخلايا وتقييم درجة تخزين الجليكوجين. في الواقع، الجليكوجين جسيمات β يمكن التعرف عليها بسهولة مع المجهر الإلكتروني والإلكترون حبيبات كثيفة 1.

<tbody><table><tr><td colspan = "4" > REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة فحص الجليكوجين</td><td>Abcam</td><td>ab65620</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> <td colspan = "4" >EQUIPMENT</td></tr> <tr><td>Fluorescence Spectrometer</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين<em&gt; في المختبر</em

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

الجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في الحيوانات الفقارية، ويلعب دورا حاسما في التمثيل الغذائي في الجسم كله، وكذلك في عملية الأيض الخلوية. العديد من الطرق للكشف عن الجليكوجين موجودة بالفعل ولكن فقط عدد قليل من الكمية. نحن هنا وصف طريقة استخدام عدة فحص Abcam الجليكوجين، والتي تقوم على تدهور محددة من الجليكوجين إلى جلوكوز عن طريق غلوكوأميلاز. ثم يتأكسد الجلوكوز خصيصا لمنتج أن يتفاعل مع التحقيق OxiRed لإنتاج مضان. المعايرة دقيقة وحساسة ويمكن أن يتحقق على مقتطفات الخلية أو أقسام الأنسجة. ومع ذلك، وعلى النقيض من تقنيات أخرى، فإنه لا يعطي معلومات حول توزيع الجليكوجين في الخلية. كمثال على هذه التقنية، وصفنا هنا المعايرة من الجليكوجين في اثنين من خطوط الخلايا والصينية CCL39 الليفية الهامستر الرئة والقولون وسرطان الإنسان LS174، المحتضنة في normoxia (21٪ O 2) مقابل نقص الأكسجة (1٪ O 2). افترضنا أن نقص الأكسجين هو سيجنال التي تعد خلايا لتجميع وتخزين الجليكوجين من أجل البقاء على قيد الحياة 1.

وهناك مستوى منخفض من الأكسجين (نقص الأكسجين) في إشارات إلى الخلايا السرطانية الأورام الحاجة إلى تخزين الطاقة للتعامل مع نضوب المغذيات لاحقة، وذلك من أجل البقاء. والجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في خلايا الثدييات، درسنا تنظيم تخزين الجليكوجين في نقص الأكسجة. يجب أن يتم تنفيذ العملية الحسابية وتوحيد تركيز الجليكوجين في الخلية لست على البيانات الخام من مضان كما هو مبين في الجدولين 1 و 2 و 3. أكد مقايسة البيوكيميائية لل...

نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان.

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو معايرة الجليكوجين في المختبر في عينات الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحلل الخلايا أولا عن طريق التعطيل الميكانيكي. الخطوة الثانية هي تحلل الجليكوجين بالأميليز ألفا للحصول على الجلوكوز.بعد ذلك ، يتأكسد الجلوكوز مما ينتج عنه نوع فلورسنت. الخطوة الأخيرة هي قياس التألق. في النهاية ، يتم استخدام المعايرة البيوكيميائية للجليكوجين لإظهار التغيرات في محتوى الجليكوجين في الخلايا.الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الموجودة هي أنها تنافسية وحساسة ودقيقة ومحددة للغاية. لبدء هذا الإجراء ، خلايا البذور بتركيز 0.5 إلى 2 مليون لكل طبق قطره 100 ملم. احتضان الخلايا لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة في نقص الأكسجة في محطة عمل لاهوائية محددة عند 1٪ أكسجين و 94٪ نيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في موازاة ذلك ، احتضان مجموعة أخرى من الخلايا في نورموكسيا لكل حالة أكسجين. قم بتغيير الوسط المحتوي على الجلوكوز 25 ملليمولار كل 24 ساعة لتقليل الاختلافات في تركيز الجلوكوز أثناء التجربة بعد العلاج. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة آثار الجلوكوز من وسط الزراعة.ثم اكشط الخلايا في جهاز الطرد المركزي PBS البارد ، محلول PBS عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الماء المقطر وأضف 100 ميكرولتر من مخزن التحلل المائي للجليكوجين الذي تم الحصول عليه من مجموعة فحص الجليكوجين.اغلي المحللة على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتعطيل الإنزيمات. بمجرد تبريد المحللة إلى درجة حرارة الغرفة ، الدوامة وأجهزة الطرد المركزي. ال lysate في 13 ، 000 مرة.الجاذبية لمدة 10 دقائق لإزالة المنتجات غير القابلة للذوبان. ثم اترك المادة الطافية جانبا لتطبيع مستويات الجليكوجين إلى محتوى البروتين بين العينات. حدد كمية البروتينات ب 25 إلى 35 ميكرولترا من المادة الطافية باستخدام مقايسة حمض bsic.بعد هذا المزيج ، 50 ميكرولترا من المادة الطافية من الخطوات السابقة مع ميكرولتر واحد من مزيج إنزيم التحلل المائي. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واتركه جانبا لتحضير معيار منحنى المعايرة ، وقم بتخفيف مجموعة الجليكوجين القياسية بمحلول التحلل المائي لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام لكل مليلتر. بعد ذلك ، أضف 0 و 4 و 8 و 12 و 16 و 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل مليلتر.قياسي لستة أنابيب منفصلة يخفف كل معيار بمخزن مؤقت للتحلل المائي لإعطاء حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر وتركيز جليكوجين يبلغ 0.04 و 0.08 و 0.12 و 0.16 و 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر على التوالي. أضف ميكرولتر واحدا من مزيج إنزيم التحلل المائي إلى المعايير واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لكل حالة أكسجين. قم بتسمية الأنبوب الأول بتركيز الجلوكوز الحر والأنابيب الثانية والثالثة كتركيز الجلوكوز الكلي.ثم أضف 15 ميكرولترا من المادة الطافية المستخرجة إلى الأنبوب الأول متبوعا ب 35 ميكرولترا من مخزن التحلل المائي لإعطاء حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولترا. سيتم قياس التألق المقابل لتركيز الجلوكوز الحر لاحقا. أضف أربعة ميكرولترات من الجليكوجين المتحلل إلى الأنبوب الثاني واضبطه على الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولترا مع محلول التحلل المائي.للحفاظ على قيم التألق ضمن تركيزات منحنى المعايرة ، أضف ميكرولترين من الجليكوجين المتحلل إلى الأنبوب الثالث واضبط على الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر مع محلول التحلل المائي. بعد ذلك ، قم بإعداد حل تطوير لجميع العينات والمعايير عن طريق خلط 48.7 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتطوير ، وميكرولتر واحد من مزيج إنزيم التطوير ، و 0.3 ميكرولتر من مسبار Oxy Redd. لكل عينة قياسية ، أضف 50 ميكرولترا من هذا المزيج إلى كل أنبوب واحتضنه في الظلام لمدة 30 دقيقة.في درجة حرارة الغرفة لقياس التألق ، اضبط الشق على ثلاثة نانومتر للإثارة والانبعاث ، ثم قم بقياس التألق. تمت دراسة تنظيم تخزين الجليكوجين ونقص الأكسجة لأن الجليكوجين هو البوليمر النشط الرئيسي للجلوكوز في خلايا الثدييات. تم إجراء حساب وتوحيد تركيز الجليكوجين في مناطق الخلية على البيانات الأولية للتألق.كما هو موضح هنا من قياسات الفلورسنت ، تم حساب إجمالي تركيز الجلوكوز الحر. باستخدام هذه النتائج ، تم تحديد كمية الجلوكوز المشتقة من الجليكوجين. أكد الفحص الكيميائي الحيوي للجليكوجين أن المجاميع الكثيفة للإلكترون التي لوحظت على الصور المجهرية الإلكترونية لخلايا ccl 39 كانت جزيئات جليكوجين.يعتمد تراكم الجليكوجين ونقص الأكسجة على عامل النسخ. يمكن استقلاب العامل الأول المحفز لنقص الأكسجة ، وهو عامل النسخ الرئيسي المشارك في التكيف الخلوي مع نقص الأكسجة في خطوط الخلايا السرطانية وغير السرطانية المخزنة بالجليكوجين بسرعة بواسطة الخلية في أقل من ست ساعات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الجليكوجين يحمي من موت الخلايا في ظل ظروف تجويع الجلوكوز بعد هذا الإجراء.أيضا ، يمكن إجراء طرق مثل المجهر الإلكتروني وتلوين التحول الحمضي الدوري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل توزيع الجليكوجين في الخلايا.

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا الفيديو مقايسة الطيف الضوئي لتقدير نشاط سينسيز الجليكوجين. تعتمد الطريقة على تقليل امتصاص NADH بمرور الوقت وتشير إلى نشاط سينسيز الجليكوجين.

الفحص الطيفي لتحديد نشاط سينسيز الجليكوجين

في هذا الفيديو ، نصف مقايسة القياس الطيفي النوعي لتحديد مدى التفرع في عينة الجليكوجين ذات البنية غير المميزة. تشير مقارنة الحد الأقصى للامتصاص للعينة غير المميزة بالسكريات ذات الهياكل المتفرعة المعروفة إلى وجود تفرع في العينة غير المميزة.

مقايسة تفرع الجليكوجين لقياس درجة تفرع الجليكوجين

تلطيخ شيف الحمضي الدوري هو تقنية تصور محتوى السكريات في الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول تلطيخ شيف الحمضي الدوري الذي تم تكييفه للاستخدام في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المنقاة من الدم الوريدي البشري. يتم إثراء هذه العينات للخلايا الليمفاوية وخلايا الدم البيضاء الأخرى في الجهاز المناعي.

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

هنا، نقدم مقايسة موثوقة وسهلة لقياس محتوى الجليكوجين في الخلايا السيانوباكتريال. الإجراء ينطوي على هطول الأمطار، اختيار البلمرة، والكشف عن بقايا الجلوكوز. هذا الأسلوب هو مناسبة لكل من ويلديب والسلالات المعدلة وراثيا ويمكن أن تسهل الهندسة الأيضية من البكتيريا الزرقاء.

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

يتم تقديم تقنيات لقياس نشاط الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، باستخدام مقياس طيف ضوئي بسيط يعمل في النطاق المرئي.

الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة

تم تحديد تركيز السكروز الأمثل لاستخراج الجليكوجين في الكبد باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. أثبتت إضافة خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لتثبيط إنزيمات تحلل الجليكوجين أنها مفيدة.

استخراج جزيئات الجليكوجين في الكبد لتحديد بنية الجليكوجين

يستخدم فحص الأنسجة الحيوانية الكشف عن التلألؤ النووي لتحديد النشاط الأنزيمي لسينسيز الجليكوجين عن طريق قياس دمج الجلوكوز المسمى راديو في الجليكوجين.

التقييم الكيميائي الإشعاعي لنشاط إنزيم سينسيز الجليكوجين في الأنسجة الحيوانية

في هذا الفيديو ، ونظهر وسيلة بديلة للكشف عن الفيروسات وtitering باستخدام تقنية الكشف عن مستضد الأنزيمية المعروفة باسم مقايسة immunoperoxidase. هنا ، فإننا سوف تظهر لك كيفية جمع العينات الخاصة بك الفيروسية ، وإعداد الخلايا لاختبار ، وأخيرا باستخدام مقايسة immunoperoxidase التخفيفات المتسلسلة لتحديد عيار الفيروسية.

معايرة Coronaviruses الإنسان باستخدام الفحص Immunoperoxidase

بعد تشكيل الأنبوب العصبي ، ويضيق الظهارة العصبية والطيات في حين أن أنبوب يملأ مع السائل النخاعي الجنينية (eCSF) لتشكيل البطينين المخ الجنينية. قمنا بتطوير هذه التقنية حقن البطين لتصور أفضل السوائل تملأ الفضاء على النقيض من الشكل ظهاري في جنين حي.

الزرد حقن الدماغ البطين

ويرد بروتوكول عام لاستخدام قياس الكالوري المعايرة متحاور لرصد ملزمة للديناميكا الحرارية مع النظم البيولوجية الانتماءات الملزمة معتدلة.

متساوي الكالوري المعايرة لقياس جزيء ضخم - يجند الانجذاب

تعلم معايرة الجليكوجين الكيميائية الحيوية في المختبر باستخدام تحليل الفلورسنت. تُستخدم هذه الطريقة لقياس مستويات الجليكوجين بدقة في العينات الخلوية ودراسة عمليات التمثيل الغذائي.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين

استكشف المزيد من الفيديوهات