المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين في المختبر

نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان.

الهدف العام من هذا الإجراء هو معايرة الجليكوجين في المختبر في عينات الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحلل الخلايا أولا عن طريق التعطيل الميكانيكي. الخطوة الثانية هي تحلل الجليكوجين بالأميليز ألفا للحصول على الجلوكوز.

بعد ذلك ، يتأكسد الجلوكوز مما ينتج عنه نوع فلورسنت. الخطوة الأخيرة هي قياس التألق. في النهاية ، يتم استخدام المعايرة البيوكيميائية للجليكوجين لإظهار التغيرات في محتوى الجليكوجين في الخلايا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الموجودة هي أنها تنافسية وحساسة ودقيقة ومحددة للغاية. لبدء هذا الإجراء ، خلايا البذور بتركيز 0.5 إلى 2 مليون لكل طبق قطره 100 ملم. احتضان الخلايا لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة في نقص الأكسجة في محطة عمل لاهوائية محددة عند 1٪ أكسجين و 94٪ نيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في موازاة ذلك ، احتضان مجموعة أخرى من الخلايا في نورموكسيا لكل حالة أكسجين. قم بتغيير الوسط المحتوي على الجلوكوز 25 ملليمولار كل 24 ساعة لتقليل الاختلافات في تركيز الجلوكوز أثناء التجربة بعد العلاج. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة آثار الجلوكوز من وسط الزراعة.

ثم اكشط الخلايا في جهاز الطرد المركزي PBS البارد ، محلول PBS عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الماء المقطر وأضف 100 ميكرولتر من مخزن التحلل المائي للجليكوجين الذي تم الحصول عليه من مجموعة فحص الجليكوجين.

اغلي المحللة على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتعطيل الإنزيمات. بمجرد تبريد المحللة إلى درجة حرارة الغرفة ، الدوامة وأجهزة الطرد المركزي. ال lysate في 13 ، 000 مرة.

الجاذبية لمدة 10 دقائق لإزالة المنتجات غير القابلة للذوبان. ثم اترك المادة الطافية جانبا لتطبيع مستويات الجليكوجين إلى محتوى البروتين بين العينات. حدد كمية البروتينات ب 25 إلى 35 ميكرولترا من المادة الطافية باستخدام مقايسة حمض bsic.

بعد هذا المزيج ، 50 ميكرولترا من المادة الطافية من الخطوات السابقة مع ميكرولتر واحد من مزيج إنزيم التحلل المائي. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واتركه جانبا لتحضير معيار منحنى المعايرة ، وقم بتخفيف مجموعة الجليكوجين القياسية بمحلول التحلل المائي لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام لكل مليلتر. بعد ذلك ، أضف 0 و 4 و 8 و 12 و 16 و 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام لكل مليلتر.

قياسي لستة أنابيب منفصلة يخفف كل معيار بمخزن مؤقت للتحلل المائي لإعطاء حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر وتركيز جليكوجين يبلغ 0.04 و 0.08 و 0.12 و 0.16 و 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر على التوالي. أضف ميكرولتر واحدا من مزيج إنزيم التحلل المائي إلى المعايير واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لكل حالة أكسجين. قم بتسمية الأنبوب الأول بتركيز الجلوكوز الحر والأنابيب الثانية والثالثة كتركيز الجلوكوز الكلي.

ثم أضف 15 ميكرولترا من المادة الطافية المستخرجة إلى الأنبوب الأول متبوعا ب 35 ميكرولترا من مخزن التحلل المائي لإعطاء حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولترا. سيتم قياس التألق المقابل لتركيز الجلوكوز الحر لاحقا. أضف أربعة ميكرولترات من الجليكوجين المتحلل إلى الأنبوب الثاني واضبطه على الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولترا مع محلول التحلل المائي.

للحفاظ على قيم التألق ضمن تركيزات منحنى المعايرة ، أضف ميكرولترين من الجليكوجين المتحلل إلى الأنبوب الثالث واضبط على الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر مع محلول التحلل المائي. بعد ذلك ، قم بإعداد حل تطوير لجميع العينات والمعايير عن طريق خلط 48.7 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتطوير ، وميكرولتر واحد من مزيج إنزيم التطوير ، و 0.3 ميكرولتر من مسبار Oxy Redd. لكل عينة قياسية ، أضف 50 ميكرولترا من هذا المزيج إلى كل أنبوب واحتضنه في الظلام لمدة 30 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة لقياس التألق ، اضبط الشق على ثلاثة نانومتر للإثارة والانبعاث ، ثم قم بقياس التألق. تمت دراسة تنظيم تخزين الجليكوجين ونقص الأكسجة لأن الجليكوجين هو البوليمر النشط الرئيسي للجلوكوز في خلايا الثدييات. تم إجراء حساب وتوحيد تركيز الجليكوجين في مناطق الخلية على البيانات الأولية للتألق.

كما هو موضح هنا من قياسات الفلورسنت ، تم حساب إجمالي تركيز الجلوكوز الحر. باستخدام هذه النتائج ، تم تحديد كمية الجلوكوز المشتقة من الجليكوجين. أكد الفحص الكيميائي الحيوي للجليكوجين أن المجاميع الكثيفة للإلكترون التي لوحظت على الصور المجهرية الإلكترونية لخلايا ccl 39 كانت جزيئات جليكوجين.

تراكم الجليكوجين ونقص الأكسجة على عامل النسخ. يمكن استقلاب العامل الأول المحفز لنقص الأكسجة ، وهو عامل النسخ الرئيسي المشارك في التكيف الخلوي مع نقص الأكسجة في خطوط الخلايا السرطانية وغير السرطانية المخزنة بالجليكوجين بسرعة بواسطة الخلية في أقل من ست ساعات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الجليكوجين يحمي من موت الخلايا في ظل ظروف تجويع الجلوكوز بعد هذا الإجراء.

أيضا ، يمكن إجراء طرق مثل المجهر الإلكتروني وتلوين التحول الحمضي الدوري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل توزيع الجليكوجين في الخلايا.