بناء مجهر عالي الدقة مع التقليدية والتصوير المجسم قدرات ملائمة بصري
أبريل 22, 2013
النظام المذكور في هذه الوثيقة توظف فخ البصرية التقليدية فضلا عن خط محاصرة البصرية الثلاثية الأبعاد مستقلة، قادرة على خلق والتلاعب الفخاخ متعددة. وهذا يسمح لإيجاد ترتيبات هندسية معقدة من الجزيئات الانكسار مع السماح أيضا عالية السرعة القياسات في وقت واحد، عالية الدقة لنشاط الإنزيمات البيولوجية.
في هذا الإجراء ، يتم تجميع ومحاذاة خط الاصطياد البصري التقليدي والثلاثي الأبعاد لتحقيق ذلك أولا ، قم بقياس مواقع المكونات البصرية ، ثم قم بتركيب المكونات بشكل آمن في مواقعها المناسبة. بعد ذلك، قم بمحاذاة البصريات للسماح بالتراكب اللوني. الخطوة الأخيرة هي حجب شعاع TED من المرآة الثلاثية الأبعاد.
في النهاية ، يسمح النظام النهائي بالاصطياد المجسم والعادي المتزامن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الاصطياد العادي وحده ، هي أنها تسمح بتحديد المواقع المتزامنة للأجسام الانكسارية المتعددة في ثلاثة أبعاد وقياسات معالجة الكائنات السريعة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التصميم والتخطيط والمحاذاة يمكن أن تكون صعبة.
نقطة البداية لهذا الفيديو هي مقعد بصري مع المجهر في مكانه لإنشاء مصيدة بصرية عند 980 نانومتر. ابدأ بأحد ثنائيات الليزر المتاحة بسهولة لهذا الطول الموجي. استخدم ليزر إمالة الخنزير مع الاستقطاب ، مع الحفاظ على الألياف أحادية الوضع ذات قطر مجال الوضع المعروف.
يجب أن تكون الألياف طويلة بما يكفي لتعمل كمرشح وضع ويجب إنهاؤها بموصل قناة ليفية إما بموصل FCPC أو موصل F-C-A-P-C. يجب التعامل مع الألياف الضوئية أحادية الوضع بعناية ، يجب تجنب التقلبات. قم بتأمين الصمام الثنائي والليزر والحامل الذي يسمح بالتحكم في الطاقة ودرجة الحرارة.
يجب تثبيت الحامل مباشرة على المقعد البصري لزيادة غرق الحرارة السلبي. بعد ذلك ، قم بتركيب موصل الألياف على بصريات تجميع الشعاع. تأكد من أن منفذ الألياف المختار يطابق قطر مجال الوضع للصمام الثنائي.
تقومألياف الضفيرة بتوصيل محول التجميع بالطاولة الضوئية على مسافة كافية من المجهر للسماح بتوسيع توجيه الحزمة ووضع المكونات الأخرى. يمكن استخدام ألوان القضيب لإصلاح تباعد العدسات للحصول على موضع قوي قابل للتكرار. اضبط منفذ الألياف لضمان نفايات شعاع متسقة عبر مسافات مماثلة لمسار الشعاع الكلي إلى المجهر.
هناك خمس مرايا في مسار شعاع الليزر DDE. بدءا من الليزر dde ، هناك مرآتان لتوجيه ناتجها إلى غلاف المجهر. يجب أن يمر الشعاع أيضا عبر مرآة ثنائية اللون ، مما يسمح بنقل غير منقوص لشعاع الصمام الثنائي بالليزر عند 45 درجة إلى زاوية الحوادث.
أخيرا ، مرآتان ثنائيتان إضافيتان قصيران تنقلان الضوء المرئي ، لكنهما يعكسان بالقرب من الأشعة تحت الحمراء وما فوق. قم بتوجيه الحزمة داخل وخارج المجهر. مساحة اللانهاية واحدة داخل مبيت المجهر لضبط المرايا ، وإزالة هدف المجهر.
استخدم المرايا وبطاقة عرض الأشعة تحت الحمراء لتوجيه الشعاع عبر فتحة العدسة في مرحلة التركيب الموضوعي. إذا كان الشعاع خارج المركز ، فاضبط المرايا لإصلاح المحاذاة بحيث تكون الحزمة في المنتصف. عند تركيب العدسات ، يمكن أن يؤدي نظام القفص إلى تجميع صلب.
يمكن استخدام الفرجار لقياس المسافات بين العدسات على طول قضبان القفص قبل التثبيت. قم بتركيب مؤشر ليزر أحمر مؤقتا مع محول مخصص بدلا من الهدف بحيث يكون شعاعه على طول المحور البصري للمجهر. استخدم شعاع مؤشر الليزر المرئي لوضع موسع الشعاع 980 نانومتر ومحاذاته تقريبا.
يستخدم هذا الإعداد عدسات بطول بؤري يبلغ 60 ملم و 125 ملم في ترتيب كيري لمضاعفة الخصر تقريبا. بعد ذلك ، قم بتثبيت عدسات التوجيه 980 نانومتر باستخدام شعاع المؤشر كدليل هنا. تحتوي كل عدسة على حامل بطول بؤري 60 ملم ، وهي العدسة الأولى في مسار الشعاع على مرحلة X و Y و Z الدقيقة مع نطاق سفر لا يقل عن نصف بوصة للسماح بتوجيه الشعاع.
يمكن الآن وضع العدسة الثانية لتشكيل ترتيب كيري واحد لواحد مع العدسة الأولى. يجب وضع هذه العدسة بحيث يتم اقترانها بصريا مع المستوى البؤري الخلفي للهدف. لتحضير المصيدة الثلاثية الأبعاد ، قم بتركيب الليزر 1064 نانومتر على منصة مرتفعة على ارتفاع شعاع 980 نانومتر تقريبا.
ضع لوحة نصف موجة ومستقطب مباشرة بعد إخراج الليزر. للسماح بالضبط اليدوي لطاقة الليزر. قم بتثبيت موسع الشعاع لهذا الليزر بحيث يتم توسيع نفايات الشعاع لتتناسب مع الحجم القطري للمرآة الثلاثية الأبعاد.
إذا كانت مقيدة بالفضاء ، فاستخدم العدسات ذات الأطوال البؤرية الصغيرة هنا ، 16 ملم و 175 ملم. استخدم الآن شعاع مؤشر الليزر لوضع معدل الضوء المكاني أو SLM ، وهو جزء من الحزمة الثلاثية الأبعاد التجارية المستخدمة. في هذه التجربة ، يجب وضع معدل الضوء المكاني بحيث يتم ترافقه بصريا مع المستوى البؤري الخلفي للهدف.
ضعه بحيث يكون لشعاع مؤشر الليزر الحد الأدنى من زاوية الحوادث الممكنة ، ولكن بحيث يقوم انعكاسه بمسح جميع الأجهزة الموجودة على الطاولة البصرية بأمان. ضع مرآة أخرى أمام موسع شعاع الليزر 1064 نانومتر لتوجيه ضوءه إلى معدل الضوء المكاني. تأكد من أن ضوء مؤشر الليزر يضرب مركز فتحة توسيع الحزمة.
أخيرا ، قم بتثبيت زوج من العدسات من التلسكوب بين معدل الضوء المكاني والمرآة ثنائية اللون. هذه العدسات لها أطوال بؤرية تبلغ 125 ملم و 200 ملم. قم بإزالة مؤشر الليزر ، واترك حامل المحول المخصص ليكون بمثابة فتحة محاذاة المقرر الدراسي.
ابدأ في التحقق من المحاذاة باستخدام شعاع 980 نانومتر فقط. استخدم عارض بطاقة الأشعة تحت الحمراء لمحاذاة شعاع 980 نانومتر للذهاب على طول المحور المركزي للفتحة في المحول المخصص. ثم استخدم بطاقة الأشعة تحت الحمراء للتأكد من أن شعاع 1064 نانومتر يضرب نفس البقع مثل شعاع 980 نانومتر على طول مسار الشعاع المشترك.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، استبدل محول تركيب مؤشر الليزر المخصص بزيت فتحة رقمية عالية أو هدف ماء. بعد ذلك ، قم بمحاذاة المصيدة 980 نانومتر عن طريق المشي على شعاع الليزر حتى يظهر نمط تداخل متماثل شعاعيا على الكاميرا مع إيقاف تشغيل المرآة الثلاثية الأبعاد. قم بمحاذاة المصيدة 1064 نانومتر باستخدام معدل الضوء المكاني وأول مرآة ثنائية اللون تمشي على شعاع الأمم المتحدة DEFRACT 1064 نانومتر.
في هذا المثال، تشير الصورة المحاذاة لكلتا التراكبات اللونية إلى محاذاة جيدة للتراكب اللوني الفعال، ولكن يمكن تحسينها بشكل أكبر. هناك أيضا انحرافات طفيفة مرتبطة بالشعاع المستدير 1064 ، حيث تصطدم بمرآة SLM مربعة ، والتي لا يمكن التخلص منها بسهولة عن طريق تحسين محاذاة العدسة. من أجل منع المصيدة الناتجة عن الحزمة الضعيفة من معدل الضوء المكاني ، أدخل جسما صغيرا معتما في مسار الضوء الضعيف في موقع مترافق مع مستوى العينة لهذا النظام.
يتم لصق كرة مجهرية معتمة بقطر 100 إلى 300 ميكرون ، وهو معدني ، على زلة أو نافذة غطاء زجاجي دائري شفاف بالأشعة تحت الحمراء. يتم وضع الكتلة في النقطة المحورية المشتركة للعدسات ، والتي يتم تقارنها بصريا بمستوى العينة. إذا تم حقن حزم الاصطياد البصري في الفضاء اللانهائي للمجهر ، فيمكن وضع مانع الشعاع لحجب الضوء غير المتسابق أو يمكن تحريكه للسماح بمرور كل الضوء.
يسمح الإعداد المجمع للمشغل بالتقاط العديد من الأجسام الانكسارية في الوقت الفعلي ووضعها في جميع الأبعاد الثلاثة في مجال الرؤية. هنا ، يتم عرض القدرات الثلاثية الأبعاد للأداة من خلال محاصرة الكريات المجهرية ، المعلقة في الماء منزوع الأيونات ، وتظهر الدوائر الحمراء والخضراء مواضع المصيدة باللون الأخضر يشير إلى مصيدة محددة لإعادة الموضع في هذا المقطع ، ويتم تسريع التشغيل بعد محاصرة الكائن. يتم إعادة وضع المصيدة يدويا.
يحتوي الترتيب النهائي على 11 خرزة تصور شعار جامعة يوتا حيث تم إجراء هذه التجربة. يسمح النظام أيضا باستخدام كل من الفخاخ الثلاثية الأبعاد والتقليدية معا. هنا يتم تحديد صفين من الفخاخ الثلاثية الأبعاد والتحكم فيها من قبل المشغل.
يتم تحديد مصيدة تقليدية إضافية بين الصفين. يرتبط الغلاف المجهري المعلق في الماء منزوع الأيونات بالفخاخ. يتم نقل الخرزة المركزية إلى أقصى إزاحة مكانية تبلغ 4.1 ميكرومتر ثم يتم دعمها إلى موقعها الأصلي في نفس الظروف.
ولكن مع تحرك الخرزة المركزية بسرعة 82 ميكرومتر في الثانية ، يتم إنتاج هذا التسلسل من الإطارات. لاحظ ضبابية الحركة في الصورتين الثانية والثالثة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تخطيط ومحاذاة نظام مصيدة بصرية مزدوجة مع مصيدة ثلاثية الأبعاد مستقلة ومصيدة عادية في نفس الإعداد.
لا تنس أن العمل باستخدام الليزر عالي الطاقة يمكن أن يكون خطيرا للغاية واتخذ الاحتياطات مثل ارتداء النظارات الواقية المناسبة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة نظامًا يدمج تقنيات التقاط البصري التقليدية والتصوير المجسم، مما يمكن معالجة عدة مصائد. يسهل هذا النهج المبتكر إنشاء ترتيبات هندسية معقدة للجسيمات الانكسارية مع السماح بقياسات عالية السرعة وعالية الدقة لنشاط الإنزيم البيولوجي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التقاط البصري
- الفيزياء الحيوية
- قياس نشاط الإنزيم
الخلفية
- تقتصر طرق التقاط البصري التقليدية في قدرتها على معالجة عدة أجسام في وقت واحد.
- يوفر التقاط البصري المجسم مرونة محسنة في تحديد المواقع ومعالجة الجسيمات.
- يمكن أن يؤدي الجمع بين هذه التقنيات إلى تحسين دقة القياس وسرعته.
- قد يواجه المستخدمون الجدد تحديات في تصميم ومحاذاة المكونات البصرية.
هدف الدراسة
- تطوير نظام يسمح بالتقاط البصري التقليدي والمجسم في وقت واحد.
- تمكين معالجة عدة أجسام انكسارية في ثلاثة أبعاد.
- تسهيل قياسات سريعة لنشاط الإنزيم البيولوجي.
الطرق المستخدمة
- تجميع المحاذاة للمكونات البصرية.
- قياس مواقع المكونات البصرية.
- تركيب المكونات بشكل آمن في المواقع المخصصة.
- محاذاة البصريات لتمكين التثبيت الفعال.
النتائج الرئيسية
- نجح النظام في دمج تقنيات التثبيت البصري التقليدية والمجسمة.
- يسمح بتحديد مواقع متعددة للأجسام الانكسارية في وقت واحد.
- تم تحقيق قياسات عالية السرعة لنشاط الإنزيم.
- أبلغ المستخدمون عن تحديات في الإعداد الأولي ولكنهم أدركوا مزايا النظام.
الاستنتاجات
- يعزز النظام المطور قدرات تقنيات التثبيت البصري.
- يوفر مزايا كبيرة للباحثين الذين يدرسون العمليات البيولوجية.
- قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التدريب للمستخدمين الجدد لإتقان الإعداد.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Optical trapping systems enable precise manipulation of refractive objects for high-resolution force and motion measurements at nanometer and piconewton scales. Integrating conventional and holographic trapping allows simultaneous multi-object positioning and real-time 3D control, supporting mechanistic studies of molecular interactions and cellular mechanics. This capability enhances predictive confidence in target validation by enabling quantitative assessment of binding forces and conformational changes under physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of molecular binding forces and complex formation dynamics.
- Operational Value: Provides functional target validation by measuring piconewton-scale forces generated by molecular motors or enzyme activity in real time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative force-displacement data that correlates with target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling controlled manipulation of dielectric beads or cellular organelles as force sensors.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through precise positioning and simultaneous readout of trap position relative to object motion.
- Scalability: Supports screening readiness via holographic pattern generation for parallel trapping of multiple objects in the field of view.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by enabling measurement of nanoscale mechanical properties in primary cells or tissue-derived models under near-physiological conditions.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery observations to preclinical validation through force-production readouts that inform target modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying how perturbations affect mechanical output in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative biophysical readouts that inform target prioritization and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct measurement of intermolecular forces and conformational changes in protein complexes.
- Screening: Delivers assay readiness through high-speed, high-resolution position tracking of trapped objects, facilitating reliable compound evaluation via force-based readouts.
- Analytics: Generates nanometer-scale displacement and piconewton-force measurements that allow teams to compare conditions and assess target modulation efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling mechanical phenotyping in disease-relevant cellular systems, supporting biomarker alignment for mechanotransduction pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multi-parametric analysis across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team standardization of force measurement protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct, label-free measurement of mechanical outputs that reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability via holographic trapping patterns and simultaneous multi-object control, improving throughput in force measurement campaigns.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets through quantitative force data, reducing late-stage failure due to unanticipated mechanical liabilities.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering objective, quantitative data on target engagement strength and conformational dynamics across candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and beam path optimization for dual-wavelength trapping systems.
- Depends on stable optical bench infrastructure, precision translation stages, and infrared-compatible components for 980 nm and 1064 nm laser integration.
- Necessitates cross-team standardization of trapping protocols, calibration procedures, and data analysis pipelines for force and displacement readouts.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-based assays to primary cells or tissue explants due to varying refractive indices and sample viability constraints.
- Limited by alignment complexity and potential aberrations from mismatched beam profiles, particularly when holographic patterns interact with spatial light modulator geometry.
