تحسين إعداد والحفاظ على شرائح الحصين ماوس لتسجيل مستقرة جدا وقابلة للتكرار من التقوية بعيدة المدى

وتعرض هذه الورقة منهجية كاملة لإعداد والحفاظ على

الهدف العام من هذا الإجراء هو أن تكون قادرا على تسجيل تقوية طويلة الأمد مستقرة للغاية وقابلة للتكرار في شرائح الحصين الحادة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج دماغ الفأر أولا وتشريح الحصين في السائل الدماغي النخاعي البارد تحت المجهر. الخطوة الثانية هي قطع شرائح الحصين المستعرضة باستخدام مروحية الأنسجة.

بعد ذلك ، يتم وضع الشريحة في غرفة تسجيل الواجهة ، والتي سيتم تعثرها بالسائل الشوكي الدماغي الاصطناعي المؤكسج. الخطوة الأخيرة هي وضع الأقطاب الكهربائية وتسجيل النشاط المشبكي في منطقة CA واحدة من الحصين. في النهاية ، يتم استخدام بروتوكول التحفيز عالي التردد لإظهار تحريض تقوية مستقرة للغاية على المدى الطويل.

من خلال هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للآلية الكامنة وراء اللدونة متشابكة. يمكن أيضا تطبيقه على نظام آخر مثل النماذج الحيوانية للتنكس العصبي أو الجهاز العصبي ، أو على الأمراض المناعية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن جميع التلاعبات تحتاج إلى مهارة كبيرة والكثير من الممارسة.

ابدأ هذا الإجراء بشطف دائرة التروية بالماء المقطر لمدة 20 دقيقة على الأقل. ثم قم بتشغيل أنظمة التدفئة. ابدأ فقاعات الكربوجين في الدائرة.

يتم تسليم الكربوجين إلى الحمام المائي أسفل غرفة التسجيل من خلال ناشرات الهواء. بعد ذلك ، تحكم في معدل التدفق في الحمام المائي بواسطة مقياس التدفق بعد ذلك ، قم بتصريف الدائرة واملأها بنقرة CSF المفلترة لإزالة الفقاعات. ثم ضع الحلقة التي ستدعم الشريحة في غرفة الاحتجاز.

قم بإزالة جميع فقاعات الهواء بعناية من الدائرة. ثم اضبط مستوى السائل الدماغي النخاعي A في غرفة التسجيل باستخدام برغي إبرة الشفط ، ويتم ضبط سرعة مضخة المدخل إلى مليلتر واحد في الدقيقة ، ويتم ضبط مضخة المخرج إلى خمسة ملليلتر في الدقيقة. قبل التشريح ، قم بإعداد جميع الأدوات الجراحية.

لإزالة دماغ الفأر المضحى. امسك رأسه بإصبعك السبابة والإبهام ، وقم بعمل شق باستخدام مقص التشريح على طول منتصف الجزء العلوي من الرأس ، بدءا من حافة المقصلة ، وقم بقصها وتشغيلها إلى العظم الأمامي. بعد ذلك ، قم بقطع العضلة الجلدية على كل جانب من جوانب الرأس لكشف صفائح الجمجمة بالكامل.

ثم قم بإزالة العضلات الموجودة في الجانب المعالج من الرأس. بعد ذلك قطع العضلة الصدغية على كل جانب على طول لوحة الصدغ. ثم قطع الألواح الأمامية في المنتصف بشكل عرضي.

الآن قم بعمل قطع صغير على العظم القذالي بين الصفيحتين. قطع في قاعدة دلل الصفائح القذالية في كل جانب. ثم باستخدام مقص الزنبرك ، قم بقص خياطة السهمية.

أخيرا ، قم بإزالة الجمجمة عن طريق نشر النصفين بعيدا عن بعضهما البعض باستخدام ملقط. الآن مع قطع المشرط قبل المخيخ مباشرة وبعد البصلة الشمية مباشرة ، ثم انقل الدماغ المستخرج بشكل عرضي إلى طبق التشريح باستخدام السائل الدماغي النخاعي البارد. بمجرد ظهور الدماغ في طبق التشريح ، افصل نصفي الكرة الأرضية عن بعضهما البعض بمشرط يتم إدخاله في المنتصف تحت مجهر جراحي مجهر ، وانشر بنية نصف الكرة الأرضية بعناية للكشف عن البطين الجانبي.

قم بإزالة جذع الدماغ والرأس عن طريق وضع ملعقة واحدة على القشرة الأمامية والملعقة الأخرى على الرأس. احرص على عدم لمس الحصين بالملعقة وعدم تمديده أثناء تقطيع الأنسجة. بعد ذلك ، اقطع فورنيكس.

ثم ادفع الحصين برفق خارج القشرة عن طريق إدخال ملعقة في البطين. عندما يتم استخراج الحصين ، قم بإزالة الأنسجة القشرية الزائدة والأوعية الدموية المتبقية باستخدام ماصة مرعى بلاستيكية واسعة الفم. انقل الحصين في ملعقة مع سطحه الآلفي لأعلى إلى منصة المفرمة.

قم بإزالة السوائل الزائدة من الملعقة باستخدام ماصة المراعي البلاستيكية القياسية. بعد ذلك ، اقلب الملعقة عموديا ولمس ورق الترشيح على المفرمة تقريبا. قم بإسقاط الحصين عن طريق لمس ورق الترشيح بسرعة.

ثم اسحب الملعقة. بعد ذلك ، قم بتوجيه الحصين وتقطيعه إلى شرائح. بشكل عرضي إلى 400 ميكرون باستخدام المروحية.

قم بتنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن. بعد ذلك ، قم بإزالة ورق الترشيح بشرائح الحصين ولفه حول الأسطوانة المعدنية لنشر الشرائح قليلا. ثم حرر الشرائح ببخاخات السائل الدماغي النخاعي باستخدام ماصة بلاستيكية رعوية قياسية واجمعها في طبق بتري مليء بالبرد.

السائل الدماغي النخاعي. انقل الشريحة المحددة إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة بلاستيكية قياسية خلفية. اسمح للشريحة بالتعافي من صدمة التشريح في غرفة واجهة التسجيل عند 28 درجة مئوية.

إذا غرقت الشريحة، فقم بخفض مستوى السائل النخاعي A إلى مستوى الشريحة، فقم برفع مستوى السائل النخاعي A مرة أخرى لجعل الشريحة تطفو. بعد ذلك ، قم بتوجيه الشريحة إلى الموضع الذي من شأنه تسهيل وضع الأقطاب الكهربائية في منطقة CA واحدة. توقف عن خفض مستوى CSF عندما يكون في الواجهة.

الغضروف المفصلي للوسائط حول الشريحة إلى مستوى كاف من السائل الدماغي النخاعي. يجب أن تكون الشبكة مشبعة بالوسائط ولكن ليست مغمورة بالكامل. ثم احتفظ بالغرفة مغطاة بأوراق الترشيح فوق الغطاء المثقوب.

دع الشريحة ترتاح لمدة ساعة و 30 دقيقة على الأقل عند 28 درجة مئوية قبل التسجيل. فيما يلي رسم تخطيطي يوضح مدخلين متشابكين مستقلين مثل واحد و S اثنين لنفس مجموعة الخلايا العصبية. تم استخدام مسار S واحد للحث على LTP بينما كان المسار S الثنائي بمثابة تحكم.

هذه هي عينة آثار F-E-P-S-P المسجلة قبل تحريض LTP مباشرة كما هو موضح في الآثار الحمراء وبعد ساعة واحدة من تحريض LDP المشار إليه بالآثار الزرقاء. فيما يلي F EPSPs من شريحة صحية تماما ، وإليك F EPSPs من شريحة تقدم مستوى عال من الاستثارة عندما لا تكون الشرائح صحية تماما. لوحظت استجابات البوليس المشبكية ، ويتم تقليل تقوية منحدر F-E-P-S-P.

فيما يلي مقارنة بين الدورات الزمنية لمنحدر F-E-P-S-P بعد LTP الناجم عن قطار واحد من التحفيز عالي التردد المسجل في 2005 و 2010 و 2011 في مختبرنا. تم تسجيل التجارب الأولى في عام 2005 المشار إليها بواسطة الدوائر المملوءة. استفادت التسجيلات اللاحقة المشار إليها بواسطة المربعات المملوءة من إجراء تشريح محسن.

تنشأ النتائج الحالية من تحسين أكسجة الواجهة والتحكم في درجة الحرارة ، جنبا إلى جنب مع توحيد القطب الكهربائي كما هو موضح في الدوائر المفتوحة. نوضح هنا أن زيادة معدل تدفق الأكسجين في الحمام المائي أسفل غرفة التسجيل من 0.15 إلى 0.25 لتر في الدقيقة كما هو موضح في المنحنى الأزرق ، يؤدي إلى انخفاض في منحدر F-E-P-S-P بنسبة 20٪ زيادة درجة الحرارة من 28 إلى 29 درجة مئوية. كما هو موضح ، يؤدي المنحنى الأخضر إلى زيادة أكثر من 50٪ في منحدر F-E-P-S-P.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كل خطوة حاسمة وأن الأخطاء في البروتوكول يمكن أن تؤدي إلى نتائج مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على تقوية مستقرة للغاية على المدى الطويل. التسجيل في شرائح الحصين الحادة.