حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور تفاعلات الخلايا البطانية للخلايا الجذعية في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال قسطرة الشريان الفخذي أولا في مخدر للوصول داخل الشرايين. خلال الخطوة الثانية ، يتم تحضير عضلة الصفاء جراحيا للفحص المجهري الفلوري داخل الحيوية.

بعد ذلك ، يتم حقن الخلايا الجذعية ذات الأهمية عبر قسطرة الشريان الفخذي. في النهاية ، يمكن تصور التفاعلات بين الخلايا الجذعية المنقولة بالتبني وبطانة دوران الأوعية الدقيقة للعضلات الرئيسية وقياسها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التجديدي ، مثل كيف يتم تنظيم هجرة الخلايا الجذعية المطبقة علاجيا داخل الكائن الحي؟

قبل البدء في الجراحة المجهرية D الهواء ، قسطرة متصلة بحقنة سعة مليلتر واحد مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم. ثم احلق الجانب الأمامي من كيس الصفن الأيمن برفق ، وكذلك الفخذ الأيمن والفخذ لفأر ذكر مخدر من 20 إلى 25 ملليغرام. اجمع كل الشعر الفضفاض باستخدام قطعة قطن مبللة ، ثم ضع الجانب البطني للفأر لأعلى على زجاج شبكي ، ومرحلة عرض مصممة خصيصا تتكون من لوحة قاعدة ولوحة ثانية عند حافة دلدل لوحة القاعدة لرفع كل من الأرجل الخلفية وكيس الصفن.

بعد تثبيت القدمين بستارة مرنة ، ضع المسرح على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم عند 37 درجة مئوية. ثم باستخدام تكبير من 10 إلى 16 ضعفا ، استخدم مجهر تشريح ومقص لعمل شق أولي في الفخذ الأيمن ، في الجزء الأمامي من الأوعية الفخذية من الركبة إلى الفخذ. حدد الشريان الفخذي واتبعه بشكل قريب ، وقم بتعبئة الشريان من الأنسجة الرخوة المحيطة.

ثم باستخدام الكي الحراري ، حدد وقطع فرع شرياني كبير يؤدي إلى الخصية اليسرى. ضع خياطة بقاء ستة أوه برولين بشكل سطحي في الخصية اليسرى. ثم تحديد وكي الفرع الشرياني الكبير الذي يمتد وسطيا عند الفخذ.

بعد ذلك ، باستخدام الجر اللطيف ، اربط الشريان الفخذي في الجزء البعيد من الفخذ الأيمن ، ثم ضع خياطة حول الشريان الفخذي القريب من مركز قدر الإمكان. الآن ، ضع عقدة فضفاضة حول الشريان الفخذي ، لكن لا تربطها. ثم ضع قوة جر لطيفة على الخيط لإنشاء التواء الشرياني.

بعد إنشاء الالتواء ، استخدم زوجا من المقصات الدقيقة لقياس حجم الشريان بعناية ، مع الحرص بشكل خاص على عدم إتلاف الوريد الفخذي. بعد ذلك ، أدخل القسطرة الدقيقة المعدة مسبقا في الشق. فك الالتواء بعناية لتسهيل مرور القسطرة.

يجب أن يكون تدفق الدم الشرياني مرئيا على الفور داخل القسطرة. تقدم القسطرة ببطء بضعة ملليمترات إلى ما بعد الالتواء السابق. ثم اربط الرباط المحضر لتثبيت القسطرة.

الآن اغسل القسطرة برفق بكلوريد الصوديوم ثم استنشق المحلول لتأكيد الموضع الصحيح للقسطرة. استخدم قطعة من الشريط اللاصق لتثبيت القسطرة بشكل أكبر في مرحلة العملية. بعد تثبيت القسطرة بشكل كاف ونقلها جانبا ، قم بقص الجلد واللفافة فوق الجانب البطني لكيس الصفن الأيمن.

الحرص على عدم لمس الأنسجة الأساسية بأي أدوات. مد الشق حتى الطية الأربية وبشكل لطيف إلى الطرف البعيد من كيس الصفن. ثم افصل بعناية الأنسجة الرخوة والضامة الأساسية فوق كيس الكريماستر دون لمس الأنسجة نفسها.

ثم ضع خياطة بقاء ستة أوه برولين في الطرف البعيد من الكريماستر لتمديد العضلات قليلا. بعد ذلك ، اسحب العضلات برفق بشكل مقر وأمام لاستئصال الأنسجة الرخوة المتبقية أسفل كيس العضلات. بعد الانفصال الكامل عن النسيج الضام ، استخدم مقصا لفتح الكيس الرئيسي C عند حافة الجمجمة وتمديد الشق من هذه الفتحة إلى الطرف البعيد للعضلة.

بعد الكي الحراري للوعاء الصغير الذي يربط الخصية على الخصية ، استخدم المقص لقطع الوصلات المتبقية بين العضلة والخصية. سوف يوضع الكريسماستر المفتوح الآن بشكل مسطح على المسرح. الآن ضع أربعة ستة أوه برولين ابق خيوطا عند حواف الأنسجة وقم بإصلاحها بالستارة المرنة.

من أجل نشر أنسجة العضلات الكريماستر من هذه النقطة فصاعدا ، استخدم حقنة سعة ملليلتر واحد لترطيب الأنسجة باستمرار باستخدام PBS. بعد أن يستريح المستحضر لمدة 15 دقيقة ، قم بحقن 0.05 إلى 0.1 ملليلتر من دكسترين رودين 1٪ عبر الشريان الفخذي الأيسر لتعزيز التباين في الأوعية الدموية الدقيقة. الآن ، حرك الماوس والمسرح تحت جهاز مقترن بشحن.

مجهر مضان متصل بكاميرا الفيديو ، معدل لإضاءة epi ، مع الحرص بشكل خاص على عدم خلع قسطرة الشريان الفخذي. بعد ضبط هدف الغمر في الماء للحصول على تصور كاف للدوران الدقيق ل chma ، حدد بشكل عشوائي ستة ES بعد الشعيرات الدموية لتحليل لاحق للالتصاق بالخلايا الجذعية الثابتة. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة سعة مليلتر واحد مع 200 ميكرولتر من الخلايا الجذعية لنخاع العظم المتبرع بالفلورسنت المسمى سابقا.

اضغط برفق على المحقنة لإريسس ، وتعليق تعليق الخلية ، ثم قم بإدارة الخلايا من خلال قسطرة الفخذ في حقن 40 ميكرولتر ليصبح المجموع خمس حقن متتالية. سجل تدحرج الخلايا الجذعية مباشرة بعد حقن الخلية. تعريف التدحرج على أنه انخفاض بنسبة تزيد عن 50٪ في سرعة الخلية على طول البطانة بطانة مع حركات العصا الخلوية النموذجية والإفراج.

بعد الانتهاء من الفحص المجهري الحيوي ، قم بإزالة عضلة الكريماستر بعناية وتخزينها لتحليلها لاحقا. بشكل عام ، يعد تفاعل الخلايا الجذعية أو السلفية المحقونة مباشرة مع بطانة الأوعية الدموية داخل دوران الأوعية الدقيقة للعضلات الكريماستر حدثا نادرا ويحدث حصريا في ما بعد الشعيرات الدموية بسبب وضع العلامات الفلورية. يمكن تمييز الخلايا المتدحرجة كما هو موضح في رأس السهم الأسود والخلايا الجذعية الملتصقة بإحكام كما هو موضح في الأسهم البيضاء ، بوضوح عن الكريات البيض الداخلية المنتشرة في es.

لا تختلف ظروف الدورة الدموية الدقيقة التي تمثلها سرعة تدفق الدم ومعدل قص الجدار بشكل كبير بين المجموعات التجريبية المعنية ذات العلاج الكيميائي المختلف. العلاج الموضعي للأنسجة العضلية الرئيسية مع كيموكينات مختلفة أو وسطاء للاستجابة الالتهابية. على سبيل المثال ، العامل الأول المشتق من الخلايا اللحمية ألفا أو عامل نخر الورم ألفا قادر على محاكاة ظروف بيئية دقيقة محددة.

تعزز هذه الظروف تفاعلات الخلايا البطانية للخلايا الجذعية بدرجات متفاوتة اعتمادا على الكيموكين أو الوسيط المحدد المطبق ومجموعة الخلايا الجذعية المحقونة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور تفاعلات الخلايا الجذعية والخلايا في الجسم الحي من خلال الفحص المجهري داخل الحيوية لدوران الأوعية الدقيقة للعضلات CreER.