لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير نموذج زراعة عصبية بشرية، وتحديد العلامات العصبية، وعزل مجموعة نقية من الخلايا العصبية لتحليل التعبير الجيني. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال زيادة تكاثر الخلايا العصبية السلفية البشرية لضمان توفير إمداد مستمر من هذه الخلايا. وكخطوة ثانية، يتم استزراع الخلايا العصبية السلفية في وجود مكملات التمايز وعوامل النمو العصبية في أطباق مطلية بعوامل الالتصاق.

بعد ذلك، يتم إجراء صبغ مناعي فلوري للمؤشرات العصبية لتحديد مصير الخلايا السليفة العصبية المتمايزة. وأخيراً، يتم إجراء تشريح مجهري بالتقاط الليزر للعصبونات المستزرعة على شرائح غشاء PEN لتسهيل تحليل التعبير الجيني الخاص بالعصبونات. وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن الخلايا السليفة العصبية المتمايزة ذات طبيعة عصبونية في الغالب.

بناءً على الصبغ المناعي الفلوري والالتقاط العصبي. ومن خلال التشريح الدقيق بالالتقاط الليزري، يمكن تكثير الخلايا السلفية العصبية البشرية وتمايزها إلى مستنبتات غنية بالعصبونات. وبالنسبة للدراسات المختبرية، ونظراً لأن هذه المستنبتات تحتوي على بعض الخلايا الدبقية، يمكننا استخدام التشريح الدقيق بالالتقاط الليزري لعزل مجموعة نقية من العصبونات.

سيقوم رون بوشارد، وهو باحث مشارك أول في مرفق المجهر المركزي لدينا، بتوضيح هذه الإجراءات. لبدء هذا الإجراء، قم بإحياء مخزون مجمد من الخلايا العصبية السلفية البشرية المعزولة من دماغ الجنين عن طريق تدفئتها بسرعة إلى 37 °C، ثم إضافتها إلى قارورة T 75 تحتوي على 15 milliliters من الوسط الأساسي العصبي المُدفأ مسبقاً، والمُدعم بـ 10 nanograms per milliliter من EGF و FGF. بعد زراعة الخلايا لمدة ثلاثة أيام، انقل الكريات العصبية إلى أنبوب سعة 15 milliliter وقم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي، مع ترك حوالي 100 µL من الوسط، ثم انقل كتلة الخلايا المترسبة إلى أنبوب إبندورف.

تعتبر كمية 100 µL من كتلة الخلايا كافية للتوزيع على قارورتين من نوع T 75. وفي حال كانت الكمية أقل، يجب تقليل عدد القارورات لأن الخلايا العصبية السلفية تفشل في التكاثر. وإذا تم توزيع الخلايا بشكل مخفف، فعندئذٍ يتم تفتيت الكريات العصبية تماماً لتحويلها إلى معلق خلوي مفرد عن طريق السحب والطرد بالماصة 50 مرة، مع إبقاء طرف الماصة سعة 200 µL ملامساً لقاع الأنبوب.

تحقق بصرياً من التقدم باستخدام المجهر لضمان تفكك الكرات العصبية. بعد ذلك، قسم معلق الخلايا بالتساوي وأضفه إلى قارورتين من نوع T 75؛ إحداهما لاستمرار التوسيع والأخرى للتمايز.

بعد ذلك، قم بتحضين الدوارق. قم بتغيير الوسط الغذائي للخلايا العصبية السلفية في الدورق المخصص للتوسع عن طريق الطرد المركزي، ثم تخلص من الوسط القديم وأضف وسطاً غذائياً جديداً.

قم بتغيير الوسط كل أربعة إلى خمسة أيام حتى تصل الكرات العصبية إلى حجمها الأصلي الذي يتراوح بين 300 إلى 500 microns. لبدء تمايز الخلايا السلفية العصبية إلى مزرعة غنية بالعصبونات، ضع شريحة غطاء واحدة في كل بئر من أطباق ذات 24 بئراً، وقم بطلاؤها بإضافة 500 µL من poly L lysine بتركيز 100 µg/mL إلى كل بئر. حضّن الأطباق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بشفط محلول poly L lysine.

اشطف الطبق بالماء المعقم منزوع الأيونات وقم بالشفط مرة أخرى. بعد ذلك، قم بطلاء آبار الطبق بـ 500 µL من الـ laminin الفأري بتركيز 5 µg/mL واتركها للحضن لمدة 30 دقيقة، وبعد الحضن، اغسل الآبار بمحلول PBS وقم بالشفط مرة أخرى واتركها لتجف في غطاء زراعة الأنسجة. بعد مرور أربعة أيام من تقسيم الخلايا، انقل الكرات العصبية الصغيرة من القارورة المخصصة للتمايز إلى طبق الـ 24 بئر المطلي.

أضف كثافة تبلغ حوالي 500 من الكرات العصبية (neurospheres) لكل بئر. بعد التحضين لمدة ست ساعات وعندما تلتصق الكرات العصبية بالطبق، قم بإزالة وسط التكاثر وأضف وسط التمايز. يتكون وسط التمايز من neuro basal medium و مكمل B 27 و N-G-F-B-D-N-F-D-B-C وحمض الريتينويك (retinoic acid). أعد الطبق إلى المحضنة؛ وبعد استزراع الخلايا العصبية السلفية في وسط التمايز العصبي لمدة أسبوعين، يتم الحصول على مستنبت غني بالعصبونات.

اشطف الخلايا العصبية مرة واحدة باستخدام PBS، ثم قم بتثبيتها في 4%paraform aldehyde لمدة 30 دقيقة. وبمجرد التثبيت، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بتجهيز الخلايا للتلوين المناعي عن طريق تحضينها مع منظم نفاذية (permeable buffer) في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.

بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة متعددة النسائل والأجسام المضادة أحادية النسائل بتركيز 3%BSA في PBS إلى الآبار. قم بإضافة زوج مختلف من الأجسام المضادة إلى كل بئر، ثم حضنها طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات Celsius في جهاز هزاز. في الصباح التالي، اغسل شرائح التغطية ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم حضنها مع أجسام مضادة ثانوية من نوع anti rabbit P SI three و anti-US fitzy في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لمدة 90 دقيقة بعد عملية التحضين.

اغسل شرائح التغطية ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم ضع 10 µL من وسط التثبيت على شريحة زجاجية. أخرج شريحة التغطية من طبق الزرع وضعها مقلوبة فوق وسط التثبيت.

امسح برفق أي فائض من وسط التثبيت ثم أحكم إغلاق الحواف باستخدام طلاء الأظافر. لتحضير الخلايا للتشريح المجهري أولاً، قم بتمايز الخلايا العصبية السلفية إلى مزرعة غنية بالعصبونات على غشاء PEN. شرائح مغلفة بـ poly L lysine و laminin.

قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظروف خالية من الـ RNA. بعد ذلك، قم بصبغ المزارع باستخدام صبغة histo gene لتصور الخلايا؛ حيث تصبغ histo gene النوى باللون الأرجواني والسيتوبلازم باللون الوردي الفاتح، مما يسهل التمييز بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من خلال مورفولوجياتها المتميزة. ضع الشريحة في إيثانول بتركيز 75% ومياه معقمة منزوعة الأيونات لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك، ضع الشريحة على منديل Kim wipe. أضف 200 µL من histo gene وانتظر لمدة 20 ثانية. تالياً، ضع الشريحة بالتتابع لمدة 30 ثانية في كل من الماء المعقم منزوع الأيونات، و75% ethanol، و95% ethanol، و100% ethanol.

بعد ذلك، يتم الغمر في الزايلين لمدة خمس دقائق والتجفيف باستخدام منديل Kim wipe لمدة خمس دقائق. ثم توضع شريحة غشاء PEN فوق الشريحة العادية، وتوضع الشريحتان في نظام Veritas لالتقاط العينات الدقيق بالليزر أو نظام LCM باستخدام البرنامج الخاص به. يتم التقاط صورة خريطة طريق لتحديد المناطق التي تحتوي على تجمعات عصبونية نقية خالية من الخلايا النجمية.

حدد هذه العصبونات باستخدام أدوات الرسم. بعد ذلك، قم بإجراء الالتقاط بالليزر لهذه المناطق باستخدام الدقة والأتمتة التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر في عملية مكونة من خطوتين. أولاً، يتم إطلاق الأشعة تحت الحمراء (IR) في نقاط متعددة بإعداد طاقة ليزر يبلغ 70 milliwatts ونبضة مدتها 2,500 microseconds لتثبيت الغشاء على الغطاء.

بعد ذلك، يتم استئصال المنطقة المحددة باستخدام أداة قطع بالأشعة فوق البنفسجية (UV) عند إعداد منخفض يبلغ 10 millivolts. يتيح الجمع بين هذه العمليات التقاط المناطق المحددة بشكل انتقائي على أغطية LCM macro caps. وعندما يتم التقاط 100 neurons كحد أدنى، استخدم المجهر لإزالة الغشاء من الغطاء ووضعه في أنبوب.

اعزل الحمض النووي الريبي الكلي (total RNA) من عينات الـ LCM باستخدام طقم عزل RNA P OPU وعالجه باستخدام DNase. بعد ذلك، قم بتضخيم الـ RNA المعزول باستخدام طقم تضخيم RNA ribo amp باتباع التعليمات المرفقة مع الطقم. وأخيراً، أجرِ تحليل R-T-P-C-R في الوقت الحقيقي باستخدام مجسات TAC MAN للكشف عن السلسلة الثقيلة للخيوط العصبية البشرية (human neurofilament heavy chain).

يتم الحصول على مزرعة غنية بالعصبونات من خلال تمايز الكرات العصبية البالغة من العمر أربعة أيام باستخدام أسطح مغطاة بـ poly L lysine واللامينين، وبالتزامن مع عوامل نمو محددة للتمايز. وبعد أسبوعين، يتم الحصول على مزرعة غنية بالعصبونات كما هو موضح هنا في المناطق ذات الكثافة المنخفضة. وقد تتمايز الخلايا إلى خلايا نجمية مثل تلك الظاهرة هنا.

يمكن توجيه تمايز الخلايا النجمية أيضاً باستخدام عامل النمو CNTF بدلاً من تلك المستخدمة لتمايز الخلايا العصبية. ويمكن تحديد تمايز الخلايا العصبية باستخدام أجسام مضادة ضد علامات عصبية محددة، وهي NeuN وsynapsin وacetylcholinesterase وsynaptophysin وBDNF وGAP 43؛ حيث يعد التلوين الإيجابي دليلاً على أن الخلايا المتمايزة تمتلك خصائص الخلايا العصبية الأولية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد الخلايا النجمية من خلال التلوين المناعي الإيجابي لـ stat three وGAP.

يتم إجراء التشريح الدقيق بالتقاط الليزر للخلايا العصبية على خلايا تم تمايزها على شرائح أغشية PEN المطلية بالبولي L ليسين واللامينين؛ وتظهر هنا خلايا عصبية مصبوغة بصبغة نسيجية. ولتوضيح الخلايا، يمكن تحديد الخلايا المستهدفة باستخدام الليزر، الذي يعمل على صهر غشاء PEN، مما يؤدي إلى التصاقها بغطاء الالتقاط الموضوع فوقها. وفي النهاية، يمكن تحديد والتقاط العديد من الخلايا على نفس الغطاء لإجراء تحليلات DNA أو RNA.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل الخلايا العصبية باستخدام التشريح الدقيق بالالتقاط الليزري.