لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير نموذج ثقافة الخلايا العصبية البشرية ، وتحديد العلامات العصبية وعزل مجموعة نقية من الخلايا العصبية لتحليل التعبير الجيني. يتم تحقيق ذلك عن طريق توسيع الخلايا السلفية العصبية البشرية أولا لإنشاء إمداد مستمر من الخلايا السلفية. كخطوة ثانية ، يتم استزراع الخلايا السلفية العصبية في وجود مكملات التمايز وعوامل النمو العصبية في الأطباق المغلفة بعوامل التعلق.

بعد ذلك ، يتم إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي للعلامات العصبية لتحديد مصير الخلايا السلفية العصبية المتمايزة. أخيرا ، يتم إجراء التشريح الدقيق لالتقاط الخلايا العصبية المزروعة على شرائح غشاء PEN لتسهيل تحليل التعبير الجيني الخاص بالخلايا العصبية. تم الحصول على النتائج التي تظهر أن الخلايا السلفية العصبية المتمايزة هي في الغالب عصبية بطبيعتها.

بناء على تلطيخ الفلورسنت المناعي والتقاط الخلايا العصبية. عن طريق التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، يمكن توسيع الخلايا السلفية العصبية البشرية وتمايزها إلى ثقافات غنية بالخلايا العصبية. بالنسبة للدراسات المختبرية ، نظرا لأن هذه الثقافات تحتوي على بعض الخلايا الجالية ، يمكننا استخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر لعزل مجموعة نقية من الخلايا العصبية.

سيوضح هذه الإجراءات رون بوشار ، باحث مشارك أول في منشأتنا الأساسية للمجهر. لبدء هذا الإجراء ، قم بإحياء مخزون مجمد من الخلايا السلفية العصبية البشرية المعزولة من دماغ الجنين عن طريق تسخينها بسرعة إلى 37 درجة مئوية ، ثم إضافتها إلى T 75 يحتوي على 15 مل من الوسط القاعدي العصبي الدافئ ، مع استكمال 10 نانوغرام لكل مليلتر ، EG ، F ، و FGF. بعد زراعة الخلايا لمدة ثلاثة أيام ، انقل المجالات العصبية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وحبيبها عن طريق الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق بعد الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية ، تاركا وراءها حوالي 100 ميكرولتر متوسط ، وانقل حبيبات الخلية إلى أنبوب einor.

100 حبيبات خلية ميكرولتر تكفي لتقسيمها إلى قارورتين T 75. إذا كان أقل ، قلل من عدد القوارير حيث تفشل الخلايا السلفية العصبية في التكاثر. إذا تم انقسامها بشكل رقيق ، فقم بتقسيم المجالات العصبية تماما إلى معلق خلية واحدة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 50 مرة مع الحفاظ على طرف 200 ميكرولتر في قاع الأنبوب.

تحقق بصريا من التقدم باستخدام المجهر لضمان انفصال المجالات العصبية. بعد ذلك ، قسم تعليق الخلية بالتساوي وأضفه إلى قارورتين T 75. واحد للتوسع المستمر والآخر للتمايز.

ثم احتضان القوارير. قم بتغيير وسط الخلايا السلفية العصبية في القارورة المميزة للتمدد عن طريق الطرد المركزي. ثم التخلص من الوسيط القديم وإضافة وسيط جديد.

قم بتغيير الوسط كل أربعة إلى خمسة أيام حتى تصل المجالات العصبية إلى حجمها الأصلي من 300 إلى 500 ميكرون. لبدء تمايز الخلايا الأسلاف العصبية إلى ثقافة غنية بالخلايا العصبية ، ضع غطاء واحد في كل بئر من 24 صفيحة بئر وقم بتغطيتها بإضافة 500 ميكرولتر من 100 ميكروغرام لكل مليلتر بولي L يسين لكل منهما. احتضن الأطباق جيدا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشق محلول البوليول ليسين.

اشطف الطبق بالماء المعقم منزوع الأيونات والشفق مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بتغطية آبار اللوحة ب 500 ميكرولتر من خمسة ميكروغرام لكل مليلتر ، ولامينين الفأر واحتضانه لمدة 30 دقيقة بعد الحضانة ، واغسل الآبار باستخدام PBS Aspirate مرة أخرى واضبطها على أن تجف في غطاء زراعة الأنسجة. بعد أربعة أيام من تقسيم الخلايا ، انقل المجالات العصبية الصغيرة من القارورة المسمى للتمايز إلى صفيحة 24 بئر مطلية.

أضف كثافة حوالي 500 مجال عصبي لكل بئر بعد الحضانة لمدة ست ساعات عندما تلتصق المجالات العصبية بالطبق ، وقم بإزالة وسط التكاثر وإضافة التمايز. متوسط يتكون من الوسط القاعدي العصبي B 27 مكمل N-G-F-B-D-N-F-D-B-C وحمض الريتينويك. أعد اللوحة إلى الحاضنة بعد زراعة الخلايا السلفية العصبية في وسط التمايز العصبي لمدة أسبوعين ، يتم الحصول على ثقافة غنية بالخلايا العصبية.

اشطف الخلايا العصبية مرة واحدة في PBS ثم قم بإصلاحها في 4٪ ألدهيد باراكولافورم لمدة 30 دقيقة. بمجرد إصلاحها ، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم قم بإعداد الخلايا للتلوين المناعي عن طريق احتضانها بمخزن مؤقت قابل للاختراق في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة متعددة النسيلة وحيدة النسيلة في 3٪ BSA في PBS إلى الآبار. بإضافة زوج مختلف من الأجسام المضادة إلى كل منهما ، احتضنهما جيدا بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في شاكر في صباح اليوم التالي. اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS ثم احتضنها بالأجسام المضادة المضادة للأرانب P SI three والأجسام المضادة الثانوية المضادة للولايات المتحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 90 دقيقة بعد الحضانة.

اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم ضع 10 ميكرولترات من وسط التركيب على شريحة زجاجية. أخرج زلة الغطاء من طبق الثقافة وضعها رأسا على عقب على وسط التثبيت.

امسح برفق أي وسيط تثبيت زائد وأغلق الحواف بطلاء الأظافر. لتحضير الخلايا للتشريح المجهري أولا ، قم بتمييز الخلايا السلفية العصبية إلى ثقافة غنية بالخلايا العصبية على غشاء القلم. شرائح مطلية ب poly L lysine و laminin.

قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف خالية من الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الثقافات باستخدام صبغة الجين الهيستو لتصور الخلايا التي تلطخ الجين النسيجي النوى الأرجواني والسيتوبلازم ، وهو وردي فاتح ، مما يجعل من السهل التمييز بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من خلال أشكالها المميزة. ضع الشريحة في 75٪ من الإيثانول والماء المعقم منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية.

ثم ضع الشريحة على مسحة كيم. أضف 200 ميكرولتر من جين histo وانتظر لمدة 20 ثانية. بعد ذلك ، ضع الشريحة بالتتابع لمدة 30 ثانية في ماء معقم منزوع الأيونات ، و 75٪ إيثانول ، و 95٪ إيثانول ، و 100٪ إيثانول.

ثم ضعيها في الزيلين لمدة خمس دقائق وجففيها على منديل كيم لمدة خمس دقائق. ثم ضع شريحة غشاء PEN فوق الشريحة العادية وضعها في نظام التشريح الدقيق للالتقاط بالليزر Veritas أو LCM باستخدام البرنامج. التقط صورة خارطة طريق للعثور على مناطق التجمعات العصبية النقية الخالية من الخلايا النجومية.

ضع علامة على هذه الخلايا العصبية باستخدام أدوات الرسم. بعد ذلك ، قم بإجراء التقاط الليزر لهذه المناطق باستخدام الدقة والأتمتة التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر في عملية من خطوتين. أولا ، يتم إطلاق الأشعة تحت الحمراء في أماكن متعددة مع إعداد طاقة ليزر يبلغ 70 مللي واط ونبضة 2 ، 500 ميكروثانية لربط الغشاء بالغطاء.

بعد ذلك ، يتم استئصال المنطقة المحددة باستخدام أداة قطع الأشعة فوق البنفسجية عند مستوى منخفض يبلغ 10 مللي فولت. يلتقط الجمع بين هذه العمليات بشكل انتقائي المناطق المحددة على أغطية ماكرو LCM الملتقطة. عندما يتم التقاط ما لا يقل عن 100 خلية عصبية ، استخدم مجهرا لإزالة الغشاء من الغطاء ووضعه على أنبوب.

عزل الحمض النووي الريبي الكلي من عينات LCM باستخدام مجموعة عزل P OPU RNA وعلاجها بالحمض النووي. ثم قم بتضخيم الحمض النووي الريبي المعزول باستخدام مجموعة تضخيم الحمض النووي الريبي الريبو أمبير باتباع التعليمات الواردة في المجموعة. أخيرا ، قم بإجراء تحليل R-T-P-C-R في الوقت الفعلي باستخدام مجسات TAC MAN للكشف عن السلسلة الثقيلة للخيوط العصبية البشرية.

يتم الحصول على ثقافة غنية بالخلايا العصبية عن طريق تمايز المجالات العصبية التي يبلغ عمرها أربعة أيام باستخدام بولي L يسين والأسطح المطلية بالصفائح بالاشتراك مع عوامل النمو المحددة للتمايز. بعد أسبوعين ، يتم الحصول على ثقافة غنية بالخلايا العصبية الموضحة هنا في المناطق ذات الكثافة المنخفضة. قد تتمايز الخلايا إلى خلايا نجمية مثل تلك التي تظهر هنا.

يمكن أيضا توجيه تمايز الخلايا النجمية باستخدام عامل النمو CNTF بدلا من تلك المستخدمة في تمايز الخلايا العصبية. يمكن تحديد تمايز الخلايا العصبية باستخدام الأجسام المضادة تجاه العلامات العصبية المحددة ، N الجديد والسينابسين ، أستيل كولينستراز وسينابتوسين ، و BDNF و GAAP 43 التلوين الإيجابي هو دليل على أن الخلايا المتمايزة لها خصائص الخلايا العصبية الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التعرف على الخلايا النجمية من خلال الإحصائيات الإيجابية الثالثة والتلوين المناعي GAP.

يتم إجراء التشريح الدقيق للخلايا العصبية بالليزر على الخلايا التي تم تمايزها على بولي ليسين وغشاء PEN المطلي باللامينين ، والشرائح الموضحة هنا عبارة عن خلايا عصبية ملطخة بصبغة هيستو. لتصور الخلايا ، يمكن بعد ذلك تحديد الخلايا ذات الأهمية باستخدام الليزر ، الذي يذوب غشاء PEN ، مما يجعله يلتصق بغطاء الالتقاط الموجود فوقه. في النهاية ، يمكن تحديد العديد من الخلايا والتقاطها على نفس الغطاء لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا العصبية باستخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر.