الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر
February 8th, 2014
المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة الانتشار لانتاج موقف ثلاثي الأبعاد والهندسة لكائن المرحلة المجهرية.
الهدف العام من التجربة التالية هو إعادة بناء الموضع ثلاثي الأبعاد في هندسة سلسلة من الخلايا البكتيرية السابحة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا البكتيرية أولا إلى التركيز الصحيح لتوفير عينة مناسبة للتصوير. كخطوة ثانية ، يتم إعداد مصدر ضوء LED ومحاذاته ، مما يسمح بالحصول على صور ثلاثية الأبعاد.
بعد ذلك ، يتم استخدام برنامج إعادة البناء من أجل الحصول على إحداثيات ثلاثية الأبعاد لسلسلة من الخلايا البكتيرية. تظهر النتائج القدرة على إعادة بناء الموضع ثلاثي الأبعاد وتكوين الخلايا البكتيرية بناء على التصوير الثلاثي الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، هي أن التصوير الحجمي الخالي من الملصقات ممكن بمعدلات إطارات عالية.
لبدء التلقيح ، 10 ملليلتر من وسائط KTY ببلورات ثلجية من مخزون مجمد من سلالة المكورات العقدية V 4 0 5 1 1 97 تحتضن ثقافة البادئ في شاكر دوار طوال الليل عند 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة. بمجرد أن يكبر ، قم بتلقيح 10 مل من وسط KTY الطازج ب 500 ميكرولتر من ثقافة المبتدئين المشبعة. احتضن لمدة 3.5 ساعة عند 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة حتى تصل الخلايا إلى كثافة بصرية بطول موجي 600 نانومتر من 0.8 إلى 1.0.
هذا يمثل تقريبا خمسة في 10 إلى الثامنة الخلايا لكل مليلتر. ثم قم بتخفيف الخلايا من واحد إلى 400 في وسائط جديدة للحصول على التركيز النهائي لحوالي 1 مليون خلية لكل مليلتر. بعد ذلك ، املأ حقنة بالفازلين واصنع حلقة من الشحوم بارتفاع ملليمتر واحد على شريحة مجهرية.
ثم ضع قطرة من محلول العينة في المنتصف. ضع غطاء زجاج برفق فوق العينة واضغط برفق على الزجاج لإغلاق الحواف ، مع التأكد من أن السائل ملامس لكل من الشريحة وزجاج الغطاء. يجب أن ينتهي بعمق غرفة العينة الناتجة من 100 إلى 200 ميكرومتر.
قم بتدوير عدسة غمر بالزيت بحجم 60 × في مكانها وأضف قطرة من الزيت. ثم ضع حجرة العينة على مرحلة المجهر بحيث يكون زجاج الغطاء متجها لأسفل. تأكد من عدم تكوين فقاعات هواء بين زلة الغطاء الزجاجي والعدسة.
ركز على السطح السفلي لغرفة العينة ثم ركز المكثف. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل الإضاءة القياسية وضع رأس LED خلف فتحة المكثف للمجهر. تأكد من ضبط المكثف على وضع المجال الساطع واضبط مصدر طاقة LED على الحد الأقصى للإخراج.
ثم أغلق فتحة المكثف إلى أقصى حد لها وادفع مؤشر LED في الحامل الخاص به حتى تتمركز الإضاءة على فتحة عدسة العدسات الشيئية. قم بتشغيل الكمبيوتر ثم أعد توجيه مسار الضوء إلى منفذ كاميرا المجهر. اضبط معدل الإطارات على 30 إطارا في الثانية وحجم الصورة إلى خمسة 12 × خمسة 12 بكسل في برنامج الحصول على الصور.
تحقق من الرسم البياني لكثافة الصورة للتأكد من عدم تشبع أي جزء من الصورة أو تعريضه ضوئيا ناقصا. يجب أن يكون وقت تعريض الإطار قصيرا قدر الإمكان مع الاحتفاظ بالتباين الجيد. إذا تجمعت الخلايا بالقرب من الواجهة، فأعد تركيز المجهر بحيث يتم إلغاء تركيز الخلايا البكتيرية قليلا.
يجب أن تقع الخلايا على بعد حوالي 10 إلى 30 ميكرون من المستوى البؤري لإعادة البناء الأمثل. بعد إعادة التركيز ، احصل على سلسلة من إطارات الفيديو واحفظها كملف VI غير مضغوط. ثم قم بتشغيل برنامج DIHM المتاح للتنزيل المجاني لتحويل إطار فيديو إلى حزمة صور معاد تركيزها عدديا.
يتم توفير أمثلة على الإطارات مع البرنامج لبدء إعادة البناء. أدخل إطار الاهتمام وخلفيته كملفات صور منفصلة في المربعات. تمثل صورة الخلفية إلى حد ما خلفية الفيديو في حالة عدم وجود الهولوغرام وسيتم استخدامها لقمع أي ضوضاء نمط ثابت قد تتداخل مع تحديد الموقع والتحليل الثلاثي الأبعاد.
بعد ذلك ، أدخل معلمات مكدس الإخراج في مربعات الإعدادات العامة. أولا ، أدخل الموضع المحوري للإطار الأول في بدء التركيز. ثم أدخل عدد الشرائح في المكدس المعاد بناؤه بعدد الخطوات ، وأخيرا ، أدخل المسافة الفعلية بين كل شريحة في المكدس بحجم الخطوة.
قم بتعيين حجم الخطوة ليكون نفس تباعد البكسل الجانبي لإعادة بناء الكائنات بالنسب الصحيحة باستخدام بيانات المثال. يجب أن تكون هذه القيمة 0.233 ميكرومتر. بعد ذلك ، أدخل إضاءة الكاميرا والطول الموجي ومعامل الانكسار المتوسط وتردد أخذ العينات الجانبي.
في مربع البكسل لكل ميكرون ، يمكن العثور على تردد أخذ العينات الجانبي للكاميرا بقسمة تكبير العدسة الموضوعية على حجم بكسل مستشعر الكاميرا. باستخدام بيانات المثال ، سيكون الرقم 60 × مقسوما على 14 ميكرومتر يساوي 4.29 بكسل لكل ميكرون. ثم إذا كان مركز الكائن مظلما في الهولوغرام ، فاضغط على زر التدرج Z.
سيؤدي هذا إلى تطبيق مرشح يستخرج الكائنات الموجودة أسفل المستوى البؤري في العينة الأصلية. ثم قم بتشغيل مرشح تمرير النطاق ، وهو المسؤول عن قمع مساهمة البكسل الصاخبة في الصورة. يتم تطبيقه على كل شريحة صورة مباشرة بعد التجيل.
بعد ذلك ، تحقق من حالة إيقاف تشغيل مفتاح الإخراج الوسيط وتأكد من تشغيله. عند تشغيل هذه المفاتيح ، سيؤدي ذلك إلى إنشاء مقطعي فيديو. الإخراج الأول هو مكدس إعادة التركيز مع اسم ملف ينتهي بمكدس V.المكدس الثاني هو عملية التدرج الفعلي مع اسم ملف ينتهي بالتدرج اللوني VI.من الناحية المثالية ، سيحتوي هذا المكدس الثاني على كائن محل اهتمام مميز ككائن ساطع على خلفية داكنة.
بعد تعيين جميع المعلمات ، اضغط على تشغيل في النافذة الرئيسية لتنفيذ الأوامر. سيظهر الإطار المحدد في المربع الرئيسي للبرنامج. ثم استخدم أداة العدسة المكبرة الموجودة على شريط الأدوات على يسار الصورة للتكبير والتصغير.
استخدم أداة المستطيل لتحديد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار والتقاط أكبر عدد ممكن من هامش الصور المجسمة داخل المستطيل لتحسين إعادة البناء. أخيرا ، اضغط على زر العملية لإنشاء مجموعتي صور منفصلتين. افحص المكدسات الناتجة باستخدام الصورة J المتوفرة في هذا الموقع.
إذا كان من الممكن رؤية الكائن محل الاهتمام بوضوح في مكدس الصور المتدرجة، فانتقل إلى قسم العرض لاستخراج إحداثيات الكائن. لبدء العرض، اضغط على زر استخراج الميزات لتمكين وظيفة موقع الإحداثيات X وY وZ. ثم أدخل مسارا وامتدادا لملف إحداثيات الإخراج ، وحدد نمط شعاع POV في مربع نمط إحداثيات الإخراج.
يؤدي هذا إلى قيام البرنامج بكتابة ملف كائن يمكن تصوره باستخدام حزمة برامج تتبع الأشعة POV المجانية ، والتي يمكن الحصول عليها من هذا الموقع ، وإعادة معالجة الصور لاستخراج إحداثيات الكائنات. سيوفر البرنامج سلسلة من إحداثيات X و Y و Z في عائد الاستثمار المحدد المكتوب على اسم الملف في مربع أسلاك الإخراج. يستغرق استخراج إحداثيات الكائنات وقتا أطول بكثير من إنشاء المكدسات.
تأكد من وجود نموذج ملف شعاع POV المرفق مع رمز إعادة الإعمار في نفس المجلد مثل ملف إحداثيات الإخراج. قم بتحرير نموذج ملف نقطة pov واستبدل اسم الملف بفواصل مقلوبة على السطر. قم بتضمين ملفي NC مع اسم ملف البيانات الذي تم إنشاؤه بواسطة رمز إعادة البناء.
ثم قم بتخصيص موضع الكاميرا والإضاءة والملمس وخيارات العرض في ضوء POV. عند الانتهاء، انقر فوق الزر تشغيل لعرض صورة نقطية. هذه صورة لسلسلة بكتيريا المكورات العقدية التي تم توجيهها مؤقتا.
انتهي إلى المستوى البؤري. يصعب إعادة بناء الكائنات الموجودة في هذا التكوين وعادة ما تنتج كائن ثنائي كبير الحجم قريبا من المستوى البؤري. تظهر هنا صورة معروضة بشكل صحيح تمثل معظم الإطارات في هذه السلسلة التي لا يتم فيها توجيه السلسلة مباشرة على طول المحور البصري.
يتم استنساخ شكل الكائن وموضعه بأمانة في العرض كما هو موضح في اللوحة الموجودة على اليمين. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بذلك في دقائق.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة استخدام التصوير المجهري الهولوغرافي الرقمي (DIHM) لإعادة بناء المواقف الهندسية والثلاثية الأبعاد للخلايا البكتيرية السبحية. تتيح التقنية تصوير حجمي بدون علامات بمعدلات إطارات عالية، مما يوفر ميزة كبيرة على الطرق التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- تقنيات التصوير
الخلفية
- التصوير المجهري الهولوغرافي الرقمي (DIHM) هو تقنية مجهرية معدلة.
- يمكنه التعرف بشكل فريد على الأجسام ذات التشتت الضعيف في ثلاثة أبعاد.
- يمكن للتصوير الهولوغرافي التقاط العمليات الديناميكية في الوقت الحقيقي.
- تتطلب الطرق الموجودة مثل التصوير المجهري المجسم في الغالب وضع علامات، مما يمكن أن يغير سلوك العينات البيولوجية.
هدف الدراسة
- إعادة بناء الموقف الهندسي ثلاثي الأبعاد للخلايا البكتيرية السبحية.
- تبيان فعالية DIHM في التقاط ديناميات الخلايا الحية.
- مقارنة مزايا DIHM بالطرق التصويرية التقليدية.
الطرق المستخدمة
- تحضير مزارع الخلايا البكتيرية بتركيزات مناسبة.
- تحاذي مصدر ضوء LED للحصول على تصوير هولوغرافي مثالي.
- استخدام برامج إعادة البناء للحصول على إحداثيات ثلاثية الأبعاد.
- تحليل الصور الهولوغرافية الناتجة لتقييم تكوين الخلايا.
النتائج الرئيسية
- نجح إعادة بناء المواقف الثلاثية الأبعاد للخلايا البكتيرية.
- أظهرت التقنية تصويرًا بمعدل إطارات عالية دون الحاجة إلى علامات.
- أظهرت النتائج ميزة واضحة على التصوير المجهري المجسم من حيث سرعة التصوير وسلامة العينة.
- ثبت أن التصوير الهولوغرافي فعال في العمليات البيولوجية الديناميكية.
الاستنتاجات
- DIHM هو أداة قوية لدراسة ديناميات الخلايا البكتيرية الحية.
- تتيح الطريقة تصويرًا ثلاثي الأبعاد مفصلًا دون تغيير العينة.
- يمكن تطبيق هذه التقنية في مناطق بحثية بيولوجية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
