التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل شبكة الأوعية الدموية في الشبكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء سلسلة من الغسيل المائي أولا على شبكية العين المعزولة. في الخطوة الثانية ، يتم هضم شبكية العين في التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعة ونصف ، اعتمادا على حجم شبكية العين.

بعد ذلك ، يتم عزل الأوعية الدموية عن طريق غسل الماء الإضافي والتشريح تحت المجهر. في النهاية ، يمكن تصور التغيرات المرضية في الأوعية الدموية مثل تمدد الأوعية الدموية الدقيقة ، والتنكس الشعري ، ونسبة الخلايا البطانية إلى الطفيليات غير الطبيعية. لذا فإن الميزة الرئيسية لمحاولة الهضم على الطرق الحالية مثل تحضير حوامل الشبكية المسطحة هي أنه يمكن تمييز شبكة الأوعية الدموية بأكملها بوضوح كبير.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها صعبة من الناحية الفنية ويصعب أدائها باستمرار. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات عزل الأوعية الدموية بالكلمات وحدها. هذه أداة قيمة للغاية في أي مختبر يقوم بإجراء دراسات بيولوجيا الأوعية الدموية في الشبكية مثل بعض الأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري ، مما يدل على أن هذه التقنية سيكون جوناثان تشاو ، طالب طب موهوب من مختبري.

بعد تثبيت عين الفأر المنزوعة البذور والفورمين المحايد بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة ، ضع العين في طبق بتري وقم بتغطيتها بكمية صغيرة من الماء. ابدأ التشريح باستخدام مقص تشريح لإجراء قطع أولي في القرنية بعناية. بعد ذلك ، أثناء الإمساك بمنطقة القطع بالملقط المستقيم ، استخدم مقصا للقطع على طول حدود القرنية والصلبة لإزالة القرنية.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا ناعما ومنحنيا ومستقيما. تقشير الصلبة والمشيمية ببطء وحذر بعيدا عن شبكية العين باتجاه العصب البصري. ثم قم بإزالة العدسة وأي قزحية زائدة وحطام من شبكية العين للمساعدة في فصل طبقات الشبكية العصبية عن الأوعية الدموية.

عند حوالي 500 ميكرولتر من الماء المصفى 45 ميكرومتر إلى صفيحة 24 بئر وضع شبكية العين في بئر ثم رجها برفق لمدة أربع إلى خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة ، مع تغيير الماء كل 30 إلى 60 دقيقة. استمر في غسل شبكية العين بالماء طوال الليل مع رج لطيف في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي ، قم بإزالة الماء وعند 3٪ من التربسين ، تحقق تحت المجهر للتأكد من عدم وجود حطام في البئر. لتجنب التصاق الأوعية الدموية بها ، قم باحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف أو بدون اهتزاز لمدة ساعة إلى ساعة ونصف.

عندما تبدأ الأنسجة في إظهار علامات التفكك ، ضع اللوحة على مرحلة المجهر ثم تجنب شبكية العين. قم بإزالة التربسين بعناية لفصل الأوعية الدموية. أولا ، أضف الماء المصفى إلى شبكية العين باستخدام الملقط.

انزع الغشاء المحدد الداخلي الذي يظهر كطبقة رقيقة وشفافة. رج الطبق بتحريض خفيف. بعد خمس دقائق ، ضع اللوحة على مرحلة المجهر مرة أخرى واستبدل الماء بعناية ، وتجنب تلف شبكية العين للمساعدة في تحرير شبكة الأوعية من أنسجة الشبكية الملتصقة.

اغسل شبكية العين كما هو موضح للتو حتى يتبقى القليل من الحطام في الماء بعد الغسيل الأخير. لذلك عادة ما تكون إزالة جميع الأنسجة غير الوعائية هي أصعب جزء من الإجراء. يمكن استخدام التقنيات التالية إما بالتسلسل أو بشكل فردي لتسهيل عزل شبكة الأوعية الدموية ، تتمثل إحدى النصائح المهمة في غمس جميع الأدوات والتربسين قبل التلاعب بشبكية العين.

يمكن أن يساعد ذلك في تجنب التصاق الأنسجة بالجهاز. قم بتغطية طرف ماصة صغيرة سعة 200 ميكرولتر بالتربسين المحجوز، ثم قم بسحب الماء بعناية لأعلى ولأسفل، بجوار أوعية الشبكية وتنفخ نحوها، مما يتسبب في تحريض لطيف. إذا كان النسيج غير الوعائي لا يزال مركزا مقاوما، فإن طرف ماصة دقيقة مطلية بالتربسين في العصب البصري وتضع ماصة شبكة الأوعية الدموية بأكملها لأعلى ولأسفل بعناية للمساعدة في تكسير الأنسجة غير الوعائية.

أخيرا ، حسنا. يمكن استخدام الملقط لرفع الأوعية الدموية برفق من الماء لإخراج أي مكونات غير وعائية ملتصقة. يجب أن تكون النتيجة النهائية شبكة الأوعية الدموية الشبكية السليمة الخالية من الحطام.

لتصور الأوعية الدموية ، ضع أولا قطرة ماء على شريحة نظيفة. ثم انقل الأوعية المهضومة إلى الماء تحت فحص النطاق. إذا تم طي حامل رفرف VAs أو فتحه ، فإن الأوعية المطوية تؤدي إلى ضعف الرؤية.

عند تلطيخها ، إذا تم طي الأنسجة ، أضف المزيد من الماء وقم بهز الشريحة برفق لتسهيل الفتح. ثم استخدم ماصة صغيرة لإزالة أي ماء زائد ببطء. المنتج النهائي للإجراء الناجح هو تركيب مسطح للشبكة الكاملة لالأوعية الدموية لشبكية الفأر مع الحفاظ على الهندسة المعمارية وتلطيخها بالهيمات والتوين والإيوين.

كما هو موضح هنا ، كما هو موضح في هذه الصورة ، يمكن ملاحظة تمايز واضح بين الخلايا البطانية والخلايا الحضاقية في شبكية العين. نوى الخلايا البطانية كما هو موضح في السهم الأبيض ، بيضاوية أو ممدودة وتقع بالكامل داخل جدار الوعاء الدموي. يشار إلى نوى الطفيليات بالسهم الأسود وهي صغيرة ، وصبغة كروية كثيفة ، ولها بشكل عام موضع بارز على طول الجدار الشعري.

التربسين والهضم هو إجراء شائع يستخدم لتحليل أمراض الأوعية الدموية في نماذج السكري. تظهر هذه الصورة مثالا على التنكس الشعري كما هو موضح بالسهم الأبيض كما لوحظ في فأر DB DB ، وهو نموذج لمرض السكري من النوع الثاني. على الرغم من أن هذا الإجراء قد تم تحسينه لشبكية العين في الفئران ، إلا أنه يمكن أيضا الحصول على نتائج مماثلة في شبكية الفئران.

من المهم ملاحظة أن شبكية العين الفئران كما هو موضح في هذه الصور ، أكبر من شبكية العين الفأرية وتتطلب 12 بدلا من 24 بينما اللوحات. شبكة الأوعية الدموية لشبكية العين الفئران هي أيضا أقل هشاشة من نظيرتها في الفئران. من الأهمية بمكان إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة غير الوعائية.

ستؤدي أي بقايا إلى تلطيخ غير محدد وتؤدي إلى ضعف تصور الأوعية الدموية. في هذه الصورة ، على سبيل المثال ، يمكن ملاحظة إزالة غير ناجحة للأنسجة غير الوعائية بأكملها. وبالمثل ، من المهم أيضا أن تتكشف شبكية العين عند التركيب لتحسين تصور الأوعية الدموية.

تظهر هذه الصورة انكشافا غير ناجح للحامل المسطح الوعائي. بعد إتقان هذا الإجراء الصعب تقنيا. يمكن أن تكون الرحلات والملخصات طريقة قيمة للغاية تسمح بتصور مفصل لشبكة الأوعية الدموية بأكملها.

من خلال تحسين هذه التقنية في عين الفأر ، يمكن للباحثين الاستفادة من الفئران التي تم التلاعب بها وراثيا لدراسة المسارات المختلفة التي يمكن أن تتحكم في الأوعية الدموية في الشبكية وتسمح لنا بفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الشبكية المختلفة. نتيجة لذلك ، يمكننا تحسين فهمنا لأمراض الأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري. من خلال دراسة نماذج الفئران مثل فأر DVDB ، يمكن أن يتيح ذلك في النهاية الفرصة للعثور على تدخلات علاجية محتملة جديدة تستهدف الأوعية الدموية في الشبكية.