Name: التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: تعلم طريقة التربسين لتحليل الأوعية الدموية الشبكية في الفئران. تتيح هذه التقنية عزل الشبكة الوعائية بأكملها مع الحفاظ على بنيتها لدراسة التغيرات المرضية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1-EY019951 (AAF)، جمعية إلينوي للوقاية من العمى (JCC، AAF)، والأموال غير المقيد إلى قسم العيون من البحوث للوقاية من العمى (RPB)، NY وRPB الطبية زمالة طالب المنحة (JCC).

1. تحضير الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استأصل العين الماوس. باستخدام يد واحدة، فتح الجفون بحيث العين مرئيا. مع من ناحية أخرى، وذلك باستخدام ملقط المنحني (صعودا تواجه المنحني)، والضغط على الجوانب الأعلى والأدنى من المدار حتى يبرز العالم. إغلاق بلطف ملقط في الجانب الخلفي من العين ورفع في حركة مستمرة لاستأصل العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح العين مع 10٪ محايدة مخزنة الفورمالين لمدة 24 ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان العين في حل PBS في طبق بتري الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج شبكية العين بعناية تحت المجهر، مع الحرص على تجنب إحداث الدموع كبيرة. إجراء الخفض الأولي في القرنية مع مقص تشريح. ثم، في حين الضغط على منطقة قطع مع ملقط على التوالي، واستخدام مقص لقطع على طول الحدود بين القرنية والصلبة إزالة القرنية. باستخدام ملقط غرامة المنحنية والمستقيمة، بعناية قشر الصلبة والمشيمية بعيدا عن الشبكية نحو العصب البصري. هذه الخطوة يتطلب الصبر كمايمكن بسرعة الافراج عن الشبكية يؤدي إلى الدموع. إزالة العدسة والقزحية أي الزائد والحطام من شبكية العين 16. </li></ol> 2. يغسل الماء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان شبكية العين في صحن 24 أيضا، وتغطي مع الماء (حوالي 500 ميكرولتر وتصفيتها مع ما لا يقل عن مرشح ميكرون 45). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير الماء كل 30 دقيقة، 1 ساعة، 4-5 مرات على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك بين عشية وضحاها في الماء مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> ملاحظة: الخطوات غسل مهمة جدا لأنها تساعد فصل طبقات الشبكية العصبية من الأوعية الدموية. 3. التربسين دايجست <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المياه وشبكية العين احتضان في محلول 3٪ التربسين (Difco 1:250) في 0.1 م تريس العازلة (درجة الحموضة 7.8) عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف للا. اكتمال التربسين هضم عندما تبدأ الأنسجة التي تظهر عليها علامات التفكك (حوالي 1.5 ساعة). ملاحظة: تجنب المصافحة السريعوهذا يمكن أن يتلف الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية، ماصة من التربسين إلى منفصلة جيدا باستخدام المجهر لتجنب لمس شبكية العين. هذا التربسين الزائدة يمكن استخدامها في وقت لاحق، عند التعامل مع السفن تحت المجهر، في الخطوة 4.3. </li></ol> 4. فصل الأوعية الدموية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء المصفى إلى شبكية العين. ثم، محاولة لتقشر الغشاء الداخلي يحد بالملقط، وذلك باستخدام مقص إذا لزم الأمر. يهز مع الإثارة خفيفة لمدة 5 دقائق. بعناية، ماصة خارج الماء تحت المجهر لتجنب إتلاف شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر يغسل الماء (لمدة 5 دقائق لكل منهما) للمساعدة في الافراج عن شبكة من الأوعية من الأنسجة الشبكية ملتصقة. يتم الانتهاء من يغسل الماء عندما يكون هناك قليل من دون الحطام المتبقي في الماء بعد الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك حاجة إلى التلاعب حذرا تحت المجهر تشريح الآن إلى مزيد من تحرير شبكة من الأوعية. وفيما يلي العديد من التقنيات المفيدة، التي يمكن استخدامها في تسلسل أو دائرة الهجرة والجنسيةividually لتحقيق النتيجة المرجوة على أساس تفضيل التقنية: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة بعناية الماء صعودا وهبوطا المتاخمة للسفن، تهب المياه في الأوعية، مما تسبب في الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة ميكرولتر 200، ماصة التربسين صعودا وهبوطا للمساعدة في الجدران معطف من ماصة. ثم، ماصة بعناية شبكة السفينة بأكمله صعودا وهبوطا مرة واحدة للمساعدة في كسر الأنسجة غير والأوعية الدموية. ملاحظة: يمكن توسيط طرف ماصة في العصب البصري بدلا من حواف شبكة الأوعية الدموية أيضا منع الأوعية الدموية من الالتصاق إلى الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بلطف الأوعية الدموية مع ملقط غرامة للخروج من الماء لطرد عناصر غير والأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يعمل الخطوات المذكورة أعلاه، إضافة التربسين إلى الشبكية للمساعدة في تحطيم الأنسجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لعدة دقائق. ثم، وإزالة التربسين وكرر الخطوات من 4،1-4،3. </li></ol></li></ol> &lt;STRONG&gt; ملاحظة: تأكد من معطف جميع الصكوك التي سوف تأتي في اتصال مع السفن في التربسين (مثل ماصة، ملقط). وهذا سوف يساعد على تجنب التصاق من الأوعية الدموية إلى المعدات. 5. تصور الأوعية الدموية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الماء على شريحة نظيفة. باستخدام ماصة ميكرولتر 200 أو ملقط، نقل السفن هضمها في الماء. تأكد من تكشفت الأوعية الدموية مسطحة جبل. والتوتر السطحي للماء يساعد على تتكشف شبكة الأوعية الدموية الآن شفاف. إذا لم تتكشف الأنسجة، وإضافة كميات إضافية من الماء ويهز بلطف الشريحة لتسهيل تتكشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المياه الزائدة ببطء شديد من قبل pipetting أو باستخدام منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح لتجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الشرائح عبر البروتوكول المناسب إما مع PAS / الهيماتوكسيلين أو H &amp; E وصمة عار. ملاحظة: PAS / الهيماتوكسيلين مفيد لتحديد جدار الوعاء الدموي والنوى الخلوية؛ H &amp; E مفيد لدemonstration من RBC كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى وجبل (Permount تصاعد متوسطة). </li></ol>

<ol><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li>
<li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li>
<li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRP%2Ftrypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li>
<li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model%3B+SHR%2FN%3AMcc-cp+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li>
<li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li>
<li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li>
<li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db%2Fdb+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li>
<li>Chapter 30. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diabetic+Retinopathy%22">Diabetic Retinopathy</a>. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).</li>
<li>Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenblatt%2C+B+%22Ophthalmology%22">Ophthalmology</a>. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).</li>
<li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li>
<li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li>
<li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li>
<li>The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html">http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html</a> (2012).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

التربسين هضم هي طريقة قياسية لتقييم الأوعية الدموية في شبكية العين. لسوء الحظ، فإنه يمثل تحديا تقنيا ويمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدل فقدان العينة إذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء صعب وخاصة في الفئران، والتي يمكن أن تحد من تطبيق هذه التقنية في النماذج الحيوانية الوراثية شيوعا من أمراض العيون. وتقدم هذه الورقة توجيهات بشأن كيفية تنفيذ الإجراء بفعالية وباستمرار في عيون الماوس. وهناك العديد من ال...

تصور الأوعية الدموية في شبكية العين نهجا هاما للغاية لتشريح آليات أمراض العيون المختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري. فإنه يسمح احد لتقييم أقرب شذوذ الأوعية الدموية، بما في ذلك microaneurysms، انحطاط الشعرية، وفقدان خلية حوطية 8،9. حتى الآن، كانت هناك العديد من التقنيات المتقدمة لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. وقد استخدم نضح من مختلف الأصباغ لتسليط الضوء على السفن، ولكن كل تقاسمت قيود مماثلة. حقن نادرا ما يسلط الضوء على الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها ما لم يعطى في الضغط العالي، الذي يهدد بتمزيق واتلاف الاوعية 1. المناعية من بطانة الأوعية الدموية مع fluorophore المسمى G isolectin B4 (اليكسا فلور 594 مترافق؛ I21413؛ إينفيتروجن؛ 1:100 تمييع) يمكن أن يتصاعد وشقة الشبكية تسليط الضوء على البنية الكلية للسفن، ولكن من دون عرض التصور من الشعيرات الدموية والأغشية الطابق السفلي وpericytes . ولوحظ من قبلFriedenwald أن السفن يمكن إبراز بواسطة تلطيخ مسطحة يتصاعد من شبكية العين مع الدوري حمض شيف (PAS) أو الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) تلطيخ 10. ومع ذلك، كان تلطيخ غير محددة إلى السفن وسلطت الضوء على الأنسجة غير والأوعية الدموية وكذلك، مما يجعل من الصعب التفريق بين الأوعية. في 1960s، وضعت كوجان وكوابارا تقنية هضم التربسين التي جعلت من السهل تصور الأوعية الدموية في شبكية العين عن طريق هضم مكونات اوعائي من شبكية العين 1. منذ ذلك الوقت، أصبح التربسين هضم طريقة المعيار الذهبي في تحليل الأوعية الدموية للشبكية العين 2-5. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن تقنيات بديلة أخرى لعزل الأوعية الدموية وقد وصفت. وقد استخدمت استخدام تحلل التناضحي لعزل الأوعية الدموية والسماح الدراسات البيوكيميائية في الأنسجة 11،12، ولكن لم يتم استخدامه الإجراء كوسيلة الأولية للدراسة تشريحية. لقد كان الأسلوب Print الأنسجةتستخدم لعزل قطاعات واسعة من الأوعية الدموية الدقيقة ويسمح للقدرة لدراسة الهندسة المعمارية تيار كهربي من الأوعية الدموية 13. من الناحية النظرية، ويمكن أيضا أن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة التغيرات التشريحية، كما نوعية السفن عالية. ومع ذلك، أنها قادرة على عزل أجزاء من شبكة الأوعية الدموية بأكملها فقط. على الرغم من أن هذه الأساليب لا يمكن أن تحل محل التربسين هضم، فمن المهم أن نلاحظ أن لديهم مزايا وعيوب مختلفة ومكملة في هذا الصدد. طريقة هضم التربسين يمثل تحديا تقنيا ويصعب تنفيذ باستمرار 6،7. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن التربسين هضم من الصعب خصوصا على نموذج الفأر، ولا سيما إذا كان أحد يرغب في الحفاظ على بنية الأوعية الدموية الشاملة للشبكية العين 6،7. وتشمل التحديات (1) الإفراط في الهضم من شبكية العين الذي يسبب خسارة كل من الأوعية الدموية وكذلك الأنسجة غير والأوعية الدموية، (2) وكيل الهضم، وتتطلبتشريح الميكانيكية واسعة النطاق والتي يمكن أن تؤدي بدورها إلى التلف من السرير السفينة، (3) فصل الفقيرة من الأنسجة غير والأوعية الدموية من الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تلطيخ غير محددة. وقد أبرزت العديد من المخطوطات لهذه التحديات، ولكن قدمت بلا بروتوكول مفصلة ومتسقة للتغلب عليها 14،15. وهذه المخطوطة تقديم منهجية خطوة بخطوة تفاصيل تقنية لتنفيذ التربسين هضم في شبكية العين الماوس والفئران مع نصائح محددة بشأن التعامل مع خطوات صعبة بشكل خاص. يتم عرض لمحة التخطيطي في الشكل 1.

<table><tbody><tr><td colspan = "4" ><قوي> الكواشف < / قوي ></td></tr> <tr><td>10٪ فورمالين محايد</td><td>مخزن فيشر Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>التربسين (1: 250)</td> <td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td>اصنع 3٪ تريبسين في 0.1 متر قاعدة تريس</td></tr><tr><td>تريزما</td><td>سيجما</td><td>T1503-1KG</td><td>قم بإنشاء 0.1 متر عازلة تريس (درجة الحموضة 7.8 @ 37 درجة ؛ ج)</td></tr> <tr><td>TRIZMA</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>زجاجة فراغ معقمة Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td>إنشاء مياه</td></tr><tr> مفلترة < td colspan = "4" >EQUIPMENT< / قوي ></td></tr> <tr><td>تشريح المجهر</td><td></td><td></td> أي <td>مجهر يسمح بالتصور الجيد لشبكية العين كاف. (10x كافية مع مسافة عمل 24 مم)</td></tr><tr><td>مقص مستقيم</td><td>أدوات العلوم الدقيقة</td><td>15024-10</td><td>حافة القطع: 8 مم ؛ قطر الحافة: 0.2 مم ؛ ملقط مستقيم 10 سم</td></tr><tr><td>(إينوكس)</td><td>Dumont # 5</td><td>11252-20</td><td>طرف Biologie ؛ 0.05 × 0.02 مم ؛ 11 سم</td></tr><tr><td>Forcepts منحني (Dumostar)</td> <td>Dumont # 7</td><td>11297-10</td><td>طرف Biologie ؛ 0.07 × 0.04 مم ؛ 11.5 سم</td></tr><tr><td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td><td>Precision Scientific</td><td>BDG59442</td><td>Shaker اختياري</td></tr><tr><td>24 بئر</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>VWR</td><td>82027-132</td><td></td></tr></tbody></table>

التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

التربسين هضم هو الأسلوب معيار الذهب لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين 1-5. فإنه يسمح التصور من شبكة كاملة من ثلاثي الأبعاد الأوعية الدموية في شبكية العين المعقدة والشعيرات الدموية من خلال خلق ثنائية الأبعاد مسطحة جبل من القنوات المترابطة الأوعية الدموية بعد هضم مكونات غير الأوعية الدموية في شبكية العين. هذا يسمح احد لدراسة مختلف التغيرات المرضية الوعائية، مثل microaneurysms، انحطاط الشعرية، والبطانية غير طبيعية إلى نسب خلية حوطية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة صعبة من الناحية التقنية، لا سيما في الفئران، التي أصبحت نموذج حيواني معظم المتاحة على نطاق واسع لدراسة شبكية العين بسبب سهولة التلاعب الجيني 6،7. في العين الماوس، فإنه من الصعوبة بمكان إزالة المكونات غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للأوعية الدموية في شبكية العين. حتى الآن، ليس هناك ندرة في الأدبيات التي تصف هضم تقنية التربسين بالتفصيل أنان الماوس. يقدم هذا المخطوط منهجية خطوة بخطوة مفصل للهضم التربسين في الماوس شبكية العين، في الوقت الذي توفر أيضا نصائح حول مخرج الخطوات الصعبة.

المنتج النهائي من إجراء الناجح هو جبل المسطح من شبكة كاملة من الأوعية الدموية في شبكية العين الماوس، مع الحفاظ على العمارة، ملطخة إما PAS / الهيماتوكسيلين أو H &amp; E، كما هو موضح في الشكلين 2-4. تمايز واضح من الخلايا البطانية وpericytes يمكن أن ينظر إليه كما هو مبين في الشكل (3). في شبكية العين، ونوى الخلايا البطانية بيضاوية أو ممدود وتقع بالكامل داخل جدار الوعاء الدموي. نواة خلية حوطية صغيرة، كروية، وصمة عار المكتظة وعموما لديه...

التربسين هضم هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. يصف هذا المخطوط الأسلوب في التفاصيل، بما في ذلك التعديلات الرئيسية لتحسين تقنية وإزالة الأنسجة غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للسفن.

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الشبكة الوعائية الشبكية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء سلسلة من عمليات الغسل بالماء للشبكية المعزولة. وفي الخطوة الثانية، يتم هضم الشبكية باستخدام trypsin عند 37 °C لمدة تتراوح بين ساعة وساعة ونصف تقريباً، وذلك اعتماداً على حجم الشبكية.بعد ذلك، يتم عزل الأوعية الدموية من خلال غسلات إضافية بالماء والتشريح تحت المجهر. وفي النهاية، يمكن معاينة التغيرات الوعائية المرضية مثل تمدد الأوعية الدموية المجهري، وتنكس الشعيرات الدموية، والنسبة غير الطبيعية للخلايا البطانية إلى الطفيليات. لذا فإن الميزة الرئيسية لطريقة "المحاولة والهضم" (try and digest) مقارنة بالطرق الحالية مثل تحضير المسحات المسطحة للشبكية هي إمكانية إبراز الشبكة الوعائية بأكملها بوضوح تام.بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنها تتطلب دقة تقنية عالية ومن الصعب تنفيذها بشكل متسق. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات عزل الأوعية الدموية من خلال الشرح اللفظي وحده. وتعتبر هذه الطريقة أداة قيمة جداً في أي مختبر يجري دراسات حول بيولوجيا الأوعية الدموية في الشبكية، مثل بعض الأمراض كاعتلال الشبكية السكري؛ وسيقوم بتوضيح هذه التقنية جوناثان تشو، وهو طالب طب موهوب من مختبري.بعد تثبيت عين الفأر المستأصلة في محلول فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% لمدة 24 ساعة، ضع العين في طبق بتري وغطّها بكمية صغيرة من الماء. ابدأ عملية التشريح باستخدام مقص تشريح لإجراء قطع أولي بعناية في القرنية. بعد ذلك، وبينما تمسك منطقة القطع بملقط مستقيم، استخدم المقص للقص على طول الحدود بين القرنية والصلبة لإزالة القرنية.بعد ذلك، استخدم ملاقط دقيقة ومنحنية ومستقيمة لفصل الصلبة والمشيمية ببطء وعناية عن الشبكية باتجاه العصب البصري. ثم قم بإزالة العدسة وأي جزء زائد من القزحية والحطام من الشبكية للمساعدة في فصل طبقات الشبكية العصبية عن الأوعية الدموية.أضف ما يقرب من 500 µL من الماء المُرشح بمسام 45 µm إلى لوحة ذات 24 بئراً، ثم ضع الشبكية في أحد الآبار ورجّها بلطف لمدة تتراوح بين أربع إلى خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة، مع تغيير الماء كل 30 إلى 60 دقيقة. استمر في غسل الشبكية في الماء طوال الليل مع الرج اللطيف في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، قم بإزالة الماء وأضف 3% trypsin، ثم افحص تحت المجهر للتأكد من عدم وجود أي شوائب في البئر. ولتجنب التصاق الأوعية الدموية، قم بحضن النسيج عند 37 °C مع رج خفيف أو بدون رج لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعة ونصف.عندما تبدأ الأنسجة في إظهار علامات التحلل، ضع الطبق على منصة المجهر، ثم تجنب الشبكية. قم بإزالة التريبسين بعناية لفصل الأوعية الدموية. أولاً، أضف الماء المفلتر إلى الشبكية باستخدام الملاقط.قم بإزالة الغشاء المحدد الداخلي، والذي يظهر كطبقة رقيقة وشفافة. قم بهز الصفيحة مع تحريك خفيف. وبعد خمس دقائق، ضع الصفيحة على منصة المجهر مرة أخرى وأعد إضافة الماء بعناية، مع تجنب إلحاق الضرر بالشبكية للمساعدة في تحرير شبكة الأوعية الدموية من أنسجة الشبكية الملتصقة.اغسل الشبكية كما تم توضيحه للتو حتى يقل أو ينعدم وجود الحطام في الماء بعد الغسلة الأخيرة. وعادة ما تكون إزالة جميع الأنسجة غير الوعائية هي الجزء الأكثر دقة في هذا الإجراء. ويمكن استخدام التقنيات التالية إما بالتتابع أو بشكل منفصل؛ ولتسهيل عزل الشبكة الوعائية، هناك نصيحة مهمة وهي غمس جميع الأدوات والتريبسين قبل التعامل مع الشبكية.يمكن أن يساعد ذلك في تجنب التصاق الأنسجة بالمعدات. قم بطلاء طرف ماصة دقيقة سعة 200 microliter بـ trypsin المحفوظ، ثم اسحب الماء وادفعه بعناية بواسطة الماصة بجوار الأوعية الشبكية ومع توجيه التدفق نحوها، مما يؤدي إلى حدوث تحريك لطيف. إذا ظل النسيج غير الوعائي مقاوماً في المركز، فضع طرف الماصة الدقيقة المطلي بـ trypsin عند العصب البصري، ثم اسحب وادفع كامل شبكة الأوعية بعناية للمساعدة في تكسير النسيج غير الوعائي.وأخيرًا، يمكن استخدام ملقط دقيق لرفع الأوعية الدموية برفق خارج الماء لإزالة أي مكونات غير وعائية ملتصقة. يجب أن تكون النتيجة النهائية شبكة أوعية دموية شبكية سليمة وخالية من الشوائب.لتصوير الأوعية الدموية، ضع أولاً قطرة من الماء على شريحة نظيفة. ثم انقل الأوعية المهضومة إلى الماء تحت فحص المجهر. إذا كان تثبيت شريحة الأوعية الدموية (VAs) مطوياً أو غير مطوي، فإن الأوعية المطوية تؤدي إلى ضعف الرؤية.عند الصبغ، إذا كانت الأنسجة مطوية، أضف كمية إضافية من الماء وهز الشريحة برفق لتسهيل عملية الفرد. ثم استخدم ماصة دقيقة لإزالة أي مياه زائدة ببطء. المنتج النهائي للإجراء الناجح هو تثبيت مسطح لكامل شبكة الأوعية الدموية في شبكية فأر، مع الحفاظ على بنيتها وصبغها باستخدام hemat, toin, and eoin.كما هو موضح هنا، وكما يظهر في هذه الصورة، يمكن ملاحظة تميز واضح بين الخلايا البطانية والخلايا حول الوعائية في الشبكية. وتكون نواى الخلايا البطانية، كما يشير السهم الأبيض، بيضاوية أو مستطيلة وتقع بالكامل داخل جدار الوعاء الدموي. أما نوى الطفيليات، والتي يشير إليها السهم الأسود، فتكون صغيرة وكروية وتصبغ بكثافة، وعادة ما تكون في وضع ناتئ على طول جدار الشعيرة الدموية.تعد عملية الهضم بالتريبسين إجراءً شائعاً يُستخدم لتحليل الاعتلالات الوعائية في النماذج الحيوانية المصابة بداء السكري. تُظهر هذه الصورة مثالاً على تنكس الشعيرات الدموية كما يشير السهم الأبيض، وهو ما لوحظ في فأر من سلالة DB DB، وهو نموذج لداء السكري من النوع الثاني. وعلى الرغم من تحسين هذا الإجراء ليتناسب مع شبكيات الفئران، إلا أنه يمكن الحصول على نتائج مماثلة في شبكيات الجرذان أيضاً.من المهم ملاحظة أن شبكيات الجرذان، كما تظهر في هذه الصور، أكبر من شبكيات الفئران وتتطلب 12 طبقاً بدلاً من 24 طبقاً. كما أن الشبكة الوعائية في شبكية الجرذ أقل هشاشة من نظيرتها في الفئران. ومن الضروري للغاية إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة غير الوعائية.سيؤدي وجود أي بقايا إلى تصبغ غير محدد، مما يؤدي إلى ضعف رؤية الأوعية الدموية. في هذه الصورة، على سبيل المثال، يمكن ملاحظة عدم إزالة كامل الأنسجة غير الوعائية بنجاح. وبالمثل، من المهم أيضاً أن تكون الشبكية مفرودة عند التثبيت من أجل تحسين رؤية الأوعية الدموية.توضح هذه الصورة فشلاً في عملية بسط العينة المسطحة للأوعية الدموية. بعد إتقان هذا الإجراء الصعب تقنيًا، يمكن أن تكون عمليات التقطيع والهضم وسيلة قيمة للغاية تتيح تصورًا تفصيليًا لشبكة الأوعية الدموية بأكملها.من خلال تحسين هذه التقنية في عين الفأر، يمكن للباحثين الاستفادة من الفئران المعدلة وراثياً لدراسة المسارات المختلفة التي يمكن أن تتحكم في الأوعية الدموية الشبكية، مما يتيح لنا فهم الفسيولوجيا المرضية لمختلف أمراض الشبكية. ونتيجة لذلك، يمكننا تعزيز فهمنا لمسببات الأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري. ومن خلال دراسة نماذج الفئران مثل فأر DVDB، يمكن أن يتيح ذلك في النهاية فرصة لإيجاد تدخلات علاجية محتملة جديدة تستهدف الأوعية الدموية الشبكية.

trypsin-digest-protocol-to-analyze-retinal-vasculature-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

منذ فترة طويلة معترف بها شبكية العين القوارض باعتبارها نافذة للوصول إلى الدماغ. في هذه الورقة التقنية التي نقدمها البروتوكول الذي يستخدم نموذج الفأر من اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين لدراسة الآليات التي تؤدي إلى فشل تجديد الأوعية الدموية داخل الجهاز العصبي المركزي بعد الإصابة الدماغية. ويمكن أيضا وصف النظام تسخيرها لاستكشاف استراتيجيات لتعزيز إعادة نمو الأوعية الدموية وظيفية داخل شبكية العين والجهاز العصبي المركزي.

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

العديد من أمراض العين تهدد الرؤية ترتبط باختلال ميكروفيسيلس الشبكية. ولذلك، من المهم قياس الاستجابات arteriole الشبكية للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة. توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل للماوس arteriole الشبكية العزلة والتحضير لتقييم آثار المواد فعال في الأوعية على قطر الأوعية الدموية.

خطوات الإعداد لقياس مفاعليه في الماوس الشرايين الشبكية السابقين فيفو

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد وتلطيخ التألق المناعي للحوامل المسطحة لشبكية العين لدى الفئران وتحليلها. يتم وصف استخدام تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) لجراء الفئران ومعالجة الصور بالتفصيل أيضا.

مراقبة النمو الديناميكي لأوعية الشبكية في نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين

وصف هنا هو بروتوكول مفصل لإجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا ونسبة الجليكوليك المقايسة في عينات الأنسجة الشبكية في الجسم الحي السابق باستخدام تحليل حيوي التجارية.

تحديد التنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في عينات الأنسجة الشبكية Ex Vivo

اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. تعد الأنسجة وفحص انهيار الحاجز الدموي والشبكية وتصوير الأوعية الفلورية تقنيات قيمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية ، والتي يمكن أن تعزز الفحص الفعال للأدوية ضد اعتلال الشبكية السكري.

التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران

تصف هذه المقالة فحص بقع اللكتين الراسخ والقابل للتكرار لمستحضرات الشبكية الكاملة والبروتوكولات المطلوبة للقياس الكمي لمعلمات الأوعية الدموية التي يتم تغييرها بشكل متكرر في اعتلال الشبكية التكاثري وغير التكاثري.

القياس الكمي للمعلمات الوعائية في شبكية العين الكاملة للفئران ذات اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري

يظهر هنا بروتوكول مفصل للكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحديد الكاسباسات ذات الصلة وظيفيا في الأنسجة المعقدة والتحقق من صحتها واستهدافها.

القياس الكمي لكاسباز-9 المناعي في أنسجة الشبكية

يمكن أن تكون نماذج الماوس أدوات مفيدة للتحقيق في بيولوجيا ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE). لقد ثبت أن الفئران يمكن أن تطور مجموعة من أمراض RPE. هنا ، نصف بروتوكول التنميط الظاهري لتوضيح وقياس أمراض RPE في الفئران باستخدام الضوء وإلكترون الانتقال والمجهر متحد البؤر.

بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر

تم تطوير مقايسة حماية لمراقبة مرونة الأوعية الدموية في شبكية العين حتى الموت من الإهانات المرتبطة بمرض السكري / اعتلال الشبكية السكري مثل الإجهاد التأكسدي والسيتوكينات.

فحص للكشف عن حماية الأوعية الدموية في شبكية العين من الموت المرتبط بمرض السكري في الفئران

لقد حددنا مؤخرا تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين كنموذج جديد لضعف الشبكية المرتبط بمرض السكري. يوضح هذا البروتوكول خطوات عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية من مزارع بطانة الشبكية ، متبوعا بوصف لتقنية قياس الصلابة باستخدام مجهر القوة الذرية.

عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية لقياس الصلابة باستخدام مجهر القوة الذرية

تم فحص الخلايا المحيطة في الأوعية الدموية الشبكية عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية β بعد الحقن المداري الرجعي ليكتين الطماطم الفلوري. تمت معالجة شبكية العين المسماة بطريقة تطهير الأنسجة وتم تركيبها بالكامل لتصور المناظر ثلاثية الأبعاد للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية الشبكية تحت مجهر متحد البؤر.

تصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الوعائية الشبكية في الفئران عن طريق التلوين المناعي 

تعلم طريقة التربسين لتحليل الأوعية الدموية الشبكية في الفئران. تتيح هذه التقنية عزل الشبكة الوعائية بأكملها مع الحفاظ على بنيتها لدراسة التغيرات المرضية بدقة.

التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر

استكشف المزيد من الفيديوهات