التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الشبكة الوعائية الشبكية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء سلسلة من عمليات الغسل بالماء للشبكية المعزولة. وفي الخطوة الثانية، يتم هضم الشبكية باستخدام trypsin عند 37 °C لمدة تتراوح بين ساعة وساعة ونصف تقريباً، وذلك اعتماداً على حجم الشبكية.

بعد ذلك، يتم عزل الأوعية الدموية من خلال غسلات إضافية بالماء والتشريح تحت المجهر. وفي النهاية، يمكن معاينة التغيرات الوعائية المرضية مثل تمدد الأوعية الدموية المجهري، وتنكس الشعيرات الدموية، والنسبة غير الطبيعية للخلايا البطانية إلى الطفيليات. لذا فإن الميزة الرئيسية لطريقة "المحاولة والهضم" (try and digest) مقارنة بالطرق الحالية مثل تحضير المسحات المسطحة للشبكية هي إمكانية إبراز الشبكة الوعائية بأكملها بوضوح تام.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنها تتطلب دقة تقنية عالية ومن الصعب تنفيذها بشكل متسق. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات عزل الأوعية الدموية من خلال الشرح اللفظي وحده. وتعتبر هذه الطريقة أداة قيمة جداً في أي مختبر يجري دراسات حول بيولوجيا الأوعية الدموية في الشبكية، مثل بعض الأمراض كاعتلال الشبكية السكري؛ وسيقوم بتوضيح هذه التقنية جوناثان تشو، وهو طالب طب موهوب من مختبري.

بعد تثبيت عين الفأر المستأصلة في محلول فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% لمدة 24 ساعة، ضع العين في طبق بتري وغطّها بكمية صغيرة من الماء. ابدأ عملية التشريح باستخدام مقص تشريح لإجراء قطع أولي بعناية في القرنية. بعد ذلك، وبينما تمسك منطقة القطع بملقط مستقيم، استخدم المقص للقص على طول الحدود بين القرنية والصلبة لإزالة القرنية.

بعد ذلك، استخدم ملاقط دقيقة ومنحنية ومستقيمة لفصل الصلبة والمشيمية ببطء وعناية عن الشبكية باتجاه العصب البصري. ثم قم بإزالة العدسة وأي جزء زائد من القزحية والحطام من الشبكية للمساعدة في فصل طبقات الشبكية العصبية عن الأوعية الدموية.

أضف ما يقرب من 500 µL من الماء المُرشح بمسام 45 µm إلى لوحة ذات 24 بئراً، ثم ضع الشبكية في أحد الآبار ورجّها بلطف لمدة تتراوح بين أربع إلى خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة، مع تغيير الماء كل 30 إلى 60 دقيقة. استمر في غسل الشبكية في الماء طوال الليل مع الرج اللطيف في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، قم بإزالة الماء وأضف 3% trypsin، ثم افحص تحت المجهر للتأكد من عدم وجود أي شوائب في البئر. ولتجنب التصاق الأوعية الدموية، قم بحضن النسيج عند 37 °C مع رج خفيف أو بدون رج لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعة ونصف.

عندما تبدأ الأنسجة في إظهار علامات التحلل، ضع الطبق على منصة المجهر، ثم تجنب الشبكية. قم بإزالة التريبسين بعناية لفصل الأوعية الدموية. أولاً، أضف الماء المفلتر إلى الشبكية باستخدام الملاقط.

قم بإزالة الغشاء المحدد الداخلي، والذي يظهر كطبقة رقيقة وشفافة. قم بهز الصفيحة مع تحريك خفيف. وبعد خمس دقائق، ضع الصفيحة على منصة المجهر مرة أخرى وأعد إضافة الماء بعناية، مع تجنب إلحاق الضرر بالشبكية للمساعدة في تحرير شبكة الأوعية الدموية من أنسجة الشبكية الملتصقة.

اغسل الشبكية كما تم توضيحه للتو حتى يقل أو ينعدم وجود الحطام في الماء بعد الغسلة الأخيرة. وعادة ما تكون إزالة جميع الأنسجة غير الوعائية هي الجزء الأكثر دقة في هذا الإجراء. ويمكن استخدام التقنيات التالية إما بالتتابع أو بشكل منفصل؛ ولتسهيل عزل الشبكة الوعائية، هناك نصيحة مهمة وهي غمس جميع الأدوات والتريبسين قبل التعامل مع الشبكية.

يمكن أن يساعد ذلك في تجنب التصاق الأنسجة بالمعدات. قم بطلاء طرف ماصة دقيقة سعة 200 microliter بـ trypsin المحفوظ، ثم اسحب الماء وادفعه بعناية بواسطة الماصة بجوار الأوعية الشبكية ومع توجيه التدفق نحوها، مما يؤدي إلى حدوث تحريك لطيف. إذا ظل النسيج غير الوعائي مقاوماً في المركز، فضع طرف الماصة الدقيقة المطلي بـ trypsin عند العصب البصري، ثم اسحب وادفع كامل شبكة الأوعية بعناية للمساعدة في تكسير النسيج غير الوعائي.

وأخيرًا، يمكن استخدام ملقط دقيق لرفع الأوعية الدموية برفق خارج الماء لإزالة أي مكونات غير وعائية ملتصقة. يجب أن تكون النتيجة النهائية شبكة أوعية دموية شبكية سليمة وخالية من الشوائب.

لتصوير الأوعية الدموية، ضع أولاً قطرة من الماء على شريحة نظيفة. ثم انقل الأوعية المهضومة إلى الماء تحت فحص المجهر. إذا كان تثبيت شريحة الأوعية الدموية (VAs) مطوياً أو غير مطوي، فإن الأوعية المطوية تؤدي إلى ضعف الرؤية.

عند الصبغ، إذا كانت الأنسجة مطوية، أضف كمية إضافية من الماء وهز الشريحة برفق لتسهيل عملية الفرد. ثم استخدم ماصة دقيقة لإزالة أي مياه زائدة ببطء. المنتج النهائي للإجراء الناجح هو تثبيت مسطح لكامل شبكة الأوعية الدموية في شبكية فأر، مع الحفاظ على بنيتها وصبغها باستخدام hemat, toin, and eoin.

كما هو موضح هنا، وكما يظهر في هذه الصورة، يمكن ملاحظة تميز واضح بين الخلايا البطانية والخلايا حول الوعائية في الشبكية. وتكون نواى الخلايا البطانية، كما يشير السهم الأبيض، بيضاوية أو مستطيلة وتقع بالكامل داخل جدار الوعاء الدموي. أما نوى الطفيليات، والتي يشير إليها السهم الأسود، فتكون صغيرة وكروية وتصبغ بكثافة، وعادة ما تكون في وضع ناتئ على طول جدار الشعيرة الدموية.

تعد عملية الهضم بالتريبسين إجراءً شائعاً يُستخدم لتحليل الاعتلالات الوعائية في النماذج الحيوانية المصابة بداء السكري. تُظهر هذه الصورة مثالاً على تنكس الشعيرات الدموية كما يشير السهم الأبيض، وهو ما لوحظ في فأر من سلالة DB DB، وهو نموذج لداء السكري من النوع الثاني. وعلى الرغم من تحسين هذا الإجراء ليتناسب مع شبكيات الفئران، إلا أنه يمكن الحصول على نتائج مماثلة في شبكيات الجرذان أيضاً.

من المهم ملاحظة أن شبكيات الجرذان، كما تظهر في هذه الصور، أكبر من شبكيات الفئران وتتطلب 12 طبقاً بدلاً من 24 طبقاً. كما أن الشبكة الوعائية في شبكية الجرذ أقل هشاشة من نظيرتها في الفئران. ومن الضروري للغاية إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة غير الوعائية.

سيؤدي وجود أي بقايا إلى تصبغ غير محدد، مما يؤدي إلى ضعف رؤية الأوعية الدموية. في هذه الصورة، على سبيل المثال، يمكن ملاحظة عدم إزالة كامل الأنسجة غير الوعائية بنجاح. وبالمثل، من المهم أيضاً أن تكون الشبكية مفرودة عند التثبيت من أجل تحسين رؤية الأوعية الدموية.

توضح هذه الصورة فشلاً في عملية بسط العينة المسطحة للأوعية الدموية. بعد إتقان هذا الإجراء الصعب تقنيًا، يمكن أن تكون عمليات التقطيع والهضم وسيلة قيمة للغاية تتيح تصورًا تفصيليًا لشبكة الأوعية الدموية بأكملها.

من خلال تحسين هذه التقنية في عين الفأر، يمكن للباحثين الاستفادة من الفئران المعدلة وراثياً لدراسة المسارات المختلفة التي يمكن أن تتحكم في الأوعية الدموية الشبكية، مما يتيح لنا فهم الفسيولوجيا المرضية لمختلف أمراض الشبكية. ونتيجة لذلك، يمكننا تعزيز فهمنا لمسببات الأمراض مثل اعتلال الشبكية السكري. ومن خلال دراسة نماذج الفئران مثل فأر DVDB، يمكن أن يتيح ذلك في النهاية فرصة لإيجاد تدخلات علاجية محتملة جديدة تستهدف الأوعية الدموية الشبكية.