توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

يتضمن هذا الإجراء استعمار البلعوم الأنفي مع العقدية الالتهاب الرئوي والاستخراج اللاحق للبكتيريا المستعمرة وكذلك الخلايا الملتصقة أو المجندة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير لقاح بكتيري للالتهاب الرئوي S. سلالة الفائدة.

ثم يتم إعطاء البكتيريا الحية عن طريق الأنف في الفئران المخدرة أثناء وجودها في جهاز تقييد بعد الطول المطلوب للاستعمار ، يتم بعد ذلك القتل الرحيم للفئران ويتم إجراء غسل الأنف عن طريق قنية القصبة الهوائية المكشوفة وطرد المحتويات من خلال nas. يمكن قياس الأعداد البكتيرية الموجودة في غسل الأنف باستخدام التقنيات الميكروبيولوجية. بدلا من ذلك ، يمكن فحص الاستجابات المناعية باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي للخلايا المجندة من النمط الظاهري أو تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.

لقياس مستويات mRNA المعبر عنها ذات الأهمية قبل البدء ، ستحتاج إلى إعداد قيود الفأر لجزء الاستعمار داخل الأنف من الإجراء والإبر المقننة لغسل الأنف. يمكن تحضير مصفاة الماوس ببساطة عن طريق قطع الطرف المدبب لأنبوب الصقر سعة 50 مل. بمجرد إنشاء الفتحة ، تأكد من استخدام المقص لتلميع أي نهايات حادة.

لتحضير الإبر المقنية ، ستحتاج إلى أنابيب البولي إيثيلين PE 20 التالية بقطر داخلي يبلغ 0.38 ملم. حقنة ميل واحدة مغطاة ب 26 وثلاث إبر مشطوفة قياس ثمانية ، وزوج من القزحية الحادة والناعمة ، والمقص ، وزوج من الملقط. قم بقص أنبوب PE 20 بالمقص الناعم إلى قطع يبلغ طولها حوالي 2.5 سم أو بوصة واحدة ، مع التأكد من أن كل طرف له طرف مشطوف.

باستخدام الملقط ، حرك إحدى هذه القطع بعناية على طرف الإبرة. لتجنب ثقب جانب الأنبوب ، يمكن الاحتفاظ بالإبر المقننة في 70٪ من الإيثانول لحين الحاجة وغسلها باستخدام PBS مباشرة قبل الاستخدام. بالنسبة للاستعمار داخل الأنف للفئران المصابة ب S pmo ، نوصي باستخدام تركيز 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة التسع لكل مل يتم تسليمها في 10 ميكرولتر.

للحصول على جرعة نهائية من 10 إلى سبعة CFU ، احتفظ باللقاح على الجليد حتى قبل الاستخدام مباشرة وتأكد من التحريض بين كل استعمار. بالإضافة إلى اللقاح، ستحتاج أيضا إلى أطراف ماصة معقمة من نوع P 10 أو P 20 ومصفاة الماوس. اعزل فأر فردي من ذيله وقم بتقييده عن طريق وضعه في جهاز تقييد الماوس المعد مسبقا.

إذا كنت تواجه مشكلة في توجيه الماوس إلى المقبلة، فقد يكون من المفيد وضعه أمام الماوس وفوقه، مما يسمح للحيوان بالزحف لأعلى. بمجرد أن يكون الماوس داخل التقييد ، قم بتثبيته من قاعدة جسمه ودفعه برفق لأعلى حتى يخرج أنفه من الطرف المدبب للمصفاة. باستخدام ماصة P 10 أو P 20 ، قم بتلقيح كل فأر عن طريق إيداع 10 ميكرولتر من المزرعة المحضرة ، وتوزيعها بالتساوي بين الاثنين. ناريس.

اسمح لللقاح بالتنقيط في الأنف عن طريق نبض التلقيح تدريجيا مع أخذ الوقت اللازم للفأر لاستنشاق اللقاح. قد يعطس الفأر بعضا من اللقاح من أنفه ، وهو أمر متوقع. لاحظ أنه يجب تخدير الفئران لهذا الإجراء لضمان بقاء البكتيريا موضعية في البلعوم الأنفي وعدم انتشارها إلى الجهاز التنفسي السفلي.

لأغراض هذا العرض التوضيحي ، نقوم بالتلقيح باستخدام PBS ، ولكن عند العمل مع البكتيريا الحية ، تأكد من إجراء الإجراء وفقا للإرشادات المعتمدة من المعهد. على سبيل المثال ، ستتطلب معظم المؤسسات إجراء الاستعمار في غطاء السلامة البيولوجية من المستوى الثاني. إذا كنت تستخدم مؤشرات الوزن كجزء من طريقة مراقبة نقطة النهاية ، فإن MA مباشرة بعد الاستعمار ، راقب الفئران كل 12 إلى 24 ساعة بحثا عن الأعراض السريرية بما في ذلك الخمول والفراء المكشكش وفقدان الوزن.

بمجرد استعمار الفئران ، احتفظ بها للمدة الزمنية المطلوبة. في نهاية هذه الفترة ، سيتم القتل الرحيم للفئران ويتم إجراء غسل الأنف لأن خلع عنق الرحم يمكن أن يؤدي إلى تلف القصبة الهوائية. يجب تجنب طريقة القتل الرحيم هذه.

قبل إجراء غسل الأنف ، تأكد من أن لديك ما يلي في متناول اليد. إبر مقنية معدة مسبقا ، 70٪ من الإيثانول المائي ، زوج من الملقط ، زوج من مقص القزحية الناعمة الحادة ، الفوسفات ، المحلول الملحي المخزن ، محلول التحلل الحمض النووي الريبي ، وأنابيب ميل إينور. بمجرد أن تصبح جاهزا للبدء ، ضع بشكل مسطح على ظهره ، وباستخدام 70٪ من الإيثانول المائي ، قم بتعقيم الجزء الأمامي من فراءه ، وخاصة منطقة الرقبة.

الحرص على منع الإيثانول من الوصول إلى النافذين. قم بعمل قطع طولي واحد على طول خط الوسط لعنق ، مما يسمح لنفسك بإنشاء فتحة لتصور القصبة الهوائية. قشر الجلد الخلفي بحذر إلى كلا الجانبين للكشف عن أنسجة الرقبة تحته.

في هذه المرحلة ، يجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية محاطة بعضلات طولية على كلا الجانبين. قم بقصها بعناية لتوفير رؤية واضحة للقصبة الهوائية نفسها ، مع الحرص على عدم قطع الأوعية الدموية المحيطة. في حالة قيامك بقطع الأوعية الدموية عن طريق الخطأ ووجود دم في المنطقة قبل المتابعة.

اسمح للنزيف بالتوقف ثم نظف المنطقة عدة مرات عن طريق توزيع PBS المعقم واستخدام شاش معقم لامتصاص الرطوبة الزائدة برفق. بمجرد أن تتعرض القصبة الهوائية بشكل صحيح ، قم بعمل قطع نصف قمري عرضي في القصبة الهوائية في منتصف الطريق تقريبا. قم بإسقاط PBS المعقم في حقنة مقنفة.

أدخل القنية في القصبة الهوائية باتجاه الأنف ، مع الحفاظ على الحافة المشطوفة متجهة إلى الأسفل لسهولة الإدخال. بمجرد وضع القنية في مكانها ، قم بالتدوير عند 180 درجة وافحص برفق لأعلى حتى تشعر بمقاومة الضوء. ضع أنبوب EEND DPH المخصص لجمع العينات أسفل أنف الماوس مباشرة.

اختبر الوضع الصحيح للقنية عن طريق توزيع كمية قليلة من سائل الغسيل PBS. بعد ذلك ، يجب أن تتشكل قطرة من السائل حول NAS للفأر إذا تم وضع القنية بشكل صحيح. إذا خرج اختبار PBS مباشرة من فم ، اسحب القنية للخلف وأعد وضعها مرة أخرى عن طريق الفحص برفق للأمام حتى تشعر بمقاومة طفيفة جدا.

احرص على عدم دفع القنية بعيدا عن هذه المقاومة حيث ستنقلها عبر الحنك الأنفي وإلى تجويف الفم. بمجرد التأكد من وضع القنية بشكل صحيح ، تابع توزيع 200 ميكرولتر من PBS بسرعة للمساعدة في إزاحة وجمع أكبر قدر من الخلايا. يجب أن يتدفق المحتوى عبر أنصاف الماوس إلى أنبوب التجميع.

ضع العينة على الفور على الثلج. يمكن فحص هذه العينات لاحقا للحمل البكتيري وكذلك التجنيد الخلوي. لجمع عينات لتحليل الحمض النووي الريبي ، استخدم إبرة مقنفة منفصلة تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي لإجراء غسل أنف ثانوي.

لاحظ أن المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي سوف ينزع الظهارة ويدمر الأنسجة المحيطة. لذلك يجب توخي الحذر لتجنب ملامسة أعضاء مثل الرئتين. إذا كان الاحتفاظ بهذه الأنسجة مطلوبا لقياس الحمل البكتيري الأنفي البلعومي ، فستحتاج إلى ما يلي.

يتم استكمال أنابيب Epicor والصفائح الميكروبيولوجية التي تحتوي على بيض الصويا ثلاثي الحروف بنسبة 5٪ من دم الأغنام. خلاط دوامة، وأطراف ماصة معقمة PBS وماصات P 20 وP 200. تعمل أولا في غطاء محرك BSL ثنائي ، وقم بإعداد سلسلة تخفيف تسلسلية لكل عينة غسل أنف mirin.

بشكل عام ، يمكن توقع تركيزات S الرئوية في البلعوم الأنفي بين صفر و 10 إلى أربعة CFU. لذلك ، قم بإجراء التخفيف التسلسلي بمقدار ثلاثة عشرة أضعاف ، وأضف 10 ميكرولترات من عينة غسل الأنف الأنيقة إلى الأنبوب الأول بتركيز 10 إلى ناقص واحد CFU لكل مل ، واستمر في الأسفل حتى تقوم بتخفيف ثلاث عينات بشكل مفرط دوامة كاملة بين كل تخفيف. يرجى ملاحظة أن هذا الفيديو مخصص لأغراض توضيحية فقط.

يجب دائما الالتزام بتقنية المختبر المناسبة، بما في ذلك تغيير أطراف الماصة بين الرقائق باستخدام شربي، قم بتقسيمها مرة أخرى إلى اللوحة المنطقية إلى أرباع وقم بتسمية الأرباع بالتخفيف المقابل المراد طلاءها عليها. ضع ثلاث قطرات من عينات 10 ميكرولتر من كل من التخفيف على لوحة أجار. اتركها تجف لمدة 15 إلى 30 دقيقة مكشوفة ثم قم بتغطية الأطباق وضعها رأسا على عقب في حاضنة بكتيرية مع الظروف المثلى لنمو المكورات الرئوية ، عادة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

احتضن هذه اللوحات لمدة 24 إلى 48 ساعة. بعد هذه الفترة الزمنية ، قم بإزالة الألواح وتحديد عدد البكتيريا المستعمرة عن طريق حساب متوسط المستعمرات المتكونة على اللوحة. لكل تخفيف ، يمكن التعرف على مستعمرات animo من خلال لونها البيج المميز ، ومناطق انحلال الدم ألفا ، وهي هالات صغيرة حول كل مستعمرة ، تم إنشاؤها عن طريق الهضم البكتيري لمكملات الدم في أجار.

وأخيرا ، عن طريق المنخفضات الصغيرة في وسط كل مستعمرة تعطيها مظهر كريات الدم الحمراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم قوي لكيفية إنشاء البلعوم الأنفي ، والاستعمار في الفأر ، وكيفية عزل البكتيريا والخلايا من البلعوم الأنفي للفأر بعد الاستعمار ، باستخدام غسل الأنف وكيفية تحديد الحمل البكتيري المقابل باستخدام التقنيات الميكروبيولوجية. نأمل أن تشجعك الطرق الموضحة في هذا الفيديو على استخدام نموذج الاستعمار داخل الأنف لدراسة استجابات المضيف لمسببات الأمراض في سياق هذه المنطقة التي لم تتم دراستها جيدا.