توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

يتضمن هذا الإجراء استعمار البلعوم الأنفي للفئران ببكتيريا streptococcus pneumonia، ومن ثم استخلاص البكتيريا المستعمرة بالإضافة إلى الخلايا الملتصقة أو المستقطبة. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير لقاح بكتيري من سلالة S pneumonia المراد دراستها أولاً.

تُحقن البكتيريا الحية بعد ذلك عن طريق الأنف في الفئران المخدرة أثناء وضعها في جهاز تثبيت. وبعد فترة الاستعمار المطلوبة، يتم قتل الفئران رحيمًا وإجراء غسيل أنفي عن طريق قسطرة الرغامى المكشوفة وشطف المحتويات عبر الأنف. ويمكن تقدير أعداد البكتيريا الموجودة في غسولات الأنف باستخدام التقنيات الميكروبيولوجية. وبدلاً من ذلك، يمكن قياس الاستجابات المناعية باستخدام إما تقنيات قياس التدفق الخلوي لتحديد النمط الظاهري للخلايا المستقطبة أو تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي qPCR.

لقياس مستويات mRNA المُعبر عنه والمستهدف قبل البدء، ستحتاج إلى تجهيز أدوات تثبيت الفئران لجزء الاستعمار داخل الأنف من الإجراء، وإبر مجهزة بالقنيات لعمليات غسيل الأنف. يمكن تجهيز أداة تثبيت الفئران ببساطة عن طريق قطع الطرف المستدق لأنبوب فالكون سعة 50 milliliter. وبمجرد إنشاء الفتحة، تأكد من استخدام المقص لصقل أي نهايات حادة.

لتحضير الإبر المكننة، ستحتاج إلى أنابيب البولي إيثيلين PE 20 بقطر داخلي يبلغ 0.38 millimeters. ومحقنة سعة 1 ml مغطاة بإبر مشطوفة مقاس 26 و 3/8 gauge، وزوج من مقصات القزحية الحادة والدقيقة، وزوج من الملاقط. قم بقص أنابيب PE 20 باستخدام المقص الدقيق إلى قطع يبلغ طولها حوالي 2.5 centimeters أو بوصة واحدة، مع التأكد من أن كل طرف ينتهي بطرف مشطوف.

باستخدام الملقط، مرر إحدى هذه القطع بعناية على طرف الإبرة. يمكن الاحتفاظ بالإبر الملقنة في ethanol بتركيز 70% حتى وقت الحاجة إليها، مع غسلها بـ PBS مباشرة قبل الاستخدام، مع تجنب ثقب جانب الأنبوب. ولإجراء الاستعمار الأنفي للفئران بـ S pmo، نوصي باستخدام تركيز 10⁹ colony forming units per mil يتم إعطاؤه في 10 µL.

للحصول على جرعة نهائية تبلغ 10^7 CFU، احفظ اللقاح على الثلج حتى قبيل الاستخدام مباشرة، وتأكد من رجّه بين كل عملية استعمار وأخرى. وبالإضافة إلى اللقاح، ستحتاج أيضاً إلى ماصة P 10 أو P 20، ورؤوس ماصات معقمة، وجهاز تثبيت الفئران الخاص بك. اعزل فأراً واحداً من ذيله وثبته بوضعه في جهاز تثبيت الفئران الذي قمت بتجهيزه مسبقاً.

إذا كنت تواجه صعوبة في توجيه الفأر إلى داخل جهاز التثبيت، فقد يساعد وضع الجهاز أمام الفأر وأعلاه، مما يسمح للحيوان بالزحف للأعلى. وبمجرد دخول الفأر في جهاز التثبيت، قم بتثبيته من قاعدة جسمه عبر دفعه بلطف نحو الأعلى حتى يبرز أنفه من الطرف المستدق للجهاز. وباستخدام ماصة P 10 أو P 20، قم بتلقيح كل فأر عن طريق وضع 10 µL من المزرعة المحضرة، مع توزيعها بالتساوي بين المنخرين.

اترك اللقاح يقطر في الأنف عن طريق دفع اللقاح بنبضات تدريجية، مع إعطاء الوقت اللازم للفأر لاستنشاق اللقاح. قد يعطس الفأر ليدفع بعض اللقاح خارج أنفه، وهذا أمر متوقع. لاحظ أنه يجب تخدير الفئران لهذا الإجراء لضمان بقاء البكتيريا موضعية في البلعوم الأنفي وعدم انتشارها إلى الجهاز التنفسي السفلي.

لأغراض هذا العرض التوضيحي، سنقوم بالتلقيح باستخدام PBS، ولكن عند العمل مع البكتيريا الحية، تأكد من إجراء العملية وفقاً للإرشادات المعتمدة في المؤسسة. على سبيل المثال، تتطلب معظم المؤسسات إجراء عملية الاستعمار داخل غطاء سلامة بيولوجية من المستوى الثاني. في حال استخدام مؤشرات الوزن كجزء من طريقة مراقبة نقطة النهاية، قم بقياس وزن الفئران مباشرة بعد الاستعمار، ثم راقب الفئران كل 12 إلى 24 ساعة لرصد الأعراض السريرية بما في ذلك الخمول، وتجعد الفراء، وفقدان الوزن.

بمجرد استعمار الفئران بالميكروبات، يتم الاحتفاظ بها للمدة المطلوبة. وفي نهاية هذه الفترة، يتم قتل الفئران رحيمًا وإجراء غسيل أنفي، حيث إن الخلع العنقي قد يؤدي إلى إتلاف الرغامي. لذا يجب تجنب طريقة القتل الرحيم هذه.

قبل إجراء عمليات الغسل الأنفي، تأكد من توفر الأدوات التالية لديك: إبر مجوفة مُعدة مسبقاً، وإيثانول مائي 70%، وملقط، ومقص قزحية دقيق وحاد، ومحلول ملحي منظم بالفوسفات، ومحلول منظم لتحلل الـ RNA، وأنابيب إبيلندورف سعة 1 ml. وبمجرد أن تصبح مستعداً للبدء، ضع الحيوان بشكل مسطح على ظهره، وقم بتعقيم الجزء الأمامي من فرائه، وخاصة منطقة الرقبة، باستخدام إيثانول مائي 70%.

مع الحرص على منع وصول الإيثانول إلى المنخرين. قم بإجراء شق طولي واحد على طول الخط الناصف لرقبة الحيوان، بما يسمح بإنشاء فتحة لرؤية الرغامى. قم بإزاحة الجلد بعناية إلى كلا الجانبين للكشف عن أنسجة الرقبة الموجودة أسفله.

في هذه المرحلة، يجب أن تكون الرغامي مرئية ومحاطة بعضلات طولية على كلا الجانبين. قم بقص هذه العضلات بعناية لتوفير رؤية واضحة للرغامي نفسها، مع الحرص على عدم قطع الأوعية الدموية المحيطة. في حال قيامك بقطع الأوعية الدموية عن طريق الخطأ ووجود دم في المنطقة قبل المتابعة.

اترك النزيف حتى يتوقف، ثم قم بتطهير المنطقة عدة مرات عن طريق وضع PBS معقم واستخدام شاش معقم لامتصاص الرطوبة الزائدة بلطف. وبمجرد كشف الرغامي بشكل صحيح، قم بإجراء قطع عرضي هلالي في الرغامي على ارتفاع منتصف المسافة تقريبًا. ضع PBS معقم في سرنجة كانيولية.

أدخل الكانيولا في الرغامي باتجاه الأنف، مع إبقاء الحافة المائلة متجهة لأسفل لتسهيل عملية الإدخال. وبمجرد استقرار الكانيولا في مكانها، قم بتدويرها بزاوية 180 درجة ثم استكشف للأعلى برفق حتى تشعر بمقاومة خفيفة. ضع أنبوب EEND DPH المخصص لجمع العينات أسفل أنف الفأر مباشرة.

اختبر الوضع الصحيح للقُنَيّة عن طريق صرف كمية ضئيلة من سائل الغسيل PBS. بعد ذلك، يجب أن تتشكل قطرة من السائل حول فتحة الأنف (NAS) للفأر إذا تم وضع القُنَيّة بشكل صحيح. أما إذا خرج سائل PBS الاختبار مباشرة من فم الحيوان، فاسحب القُنَيّة للخلف وأعد وضعها مرة أخرى عن طريق سبرها للأمام بلطف حتى تشعر بمقاومة طفيفة جداً.

احذر من دفع القنية بعيداً جداً بعد هذه المقاومة، لأن ذلك سيؤدي إلى تحريكها متجاوزةً الحنك الأنفي وصولاً إلى التجويف الفموي. بمجرد التأكد من وضع القنية بشكل صحيح، ابدأ بصرف 200 µL من PBS بسرعة للمساعدة في إزاحة وجمع أكبر كمية من الخلايا. يجب أن تتدفق المحتويات عبر منخري الفأر وإلى أنبوب الجمع.

ضع العينة على الثلج فوراً. يمكن بعد ذلك تحليل هذه العينات لتقدير الحمل البكتيري وكذلك الاستقطاب الخلوي. ولجمع عينات لتحليل RNA، استخدم إبرة كانيولا منفصلة تحتوي على 500 µL من منظم تحلل RNA لإجراء غسيل أنفي ثانوي.

لاحظ أن منظم تحليل الحمض النووي الريبي (RNA lysis buffer) سيعمل على تعرية الظهارة وتدمير الأنسجة المحيطة. لذا يجب توخي الحذر لتجنب ملامسة أعضاء مثل الرئتين. إذا كنت ترغب في الاحتفاظ بهذه الأنسجة لتقدير الحمل البكتيري في البلعوم الأنفي، فستحتاج إلى ما يلي.

أنابيب Epicor، وأطباق ميكروبيولوجية تحتوي على وسط triptych soy egg مدعم بـ 5% من دم الضأن. جهاز مزج دوامي (vortex mixer)، ورؤوس ماصات معقمة لـ PBS، وماصات P 20 وP 200. أولاً، وبالعمل داخل غطاء أمان حيوي من المستوى الثاني (BSL two hood)، يتم تحضير سلسلة تخفيفات متتالية لكل عينة من غسيل الأنف للميرين.

بشكل عام، من المتوقع أن تتراوح تركيزات S pneumoniae في البلعوم الأنفي بين صفر و10⁴ CFU. لذلك، قم بإجراء ثلاثة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف، وأضف 10 µL من عينة الغسيل الأنفي الخام إلى الأنبوب الأول للوصول إلى تركيز 10⁻¹ CFU لكل مل، واستمر في التخفيف نزولاً حتى يتم تخفيف ثلاث عينات بشكل مفرط، مع الرج الجيد باستخدام جهاز الفورتكس (vortex) بين كل عملية تخفيف. يرجى ملاحظة أن هذا الفيديو مخصص لأغراض توضيحية فقط.

يجب الالتزام دائمًا بالتقنيات المخبرية السليمة، بما في ذلك تغيير رؤوس الماصات بين التخفيفات. باستخدام قلم تحديد، قم بتقسيم الطبق المنطقي الخاص بك إلى أربعة أرباع، وضع علامة على كل ربع بالتخفيف المقابل الذي سيتم زرعه فيه. قم بتوزيع ثلاث قطرات من عينات بحجم 10 microliter من كل تخفيف على طبق الآجار. اترك هذه العينات لتجف لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة دون غطاء، ثم قم بتغطية الأطباق ووضعها مقلوبة في حاضنة بكتيرية تتوفر فيها الظروف المثالية لنمو المكورات الرئوية، وعادة ما تكون 37 degrees Celsius و 5%CO2.

قم بحضن هذه الأطباق لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة. بعد انقضاء هذه الفترة، أخرج الأطباق وحدد عدد البكتيريا المستعمرة عن طريق حساب متوسط المستعمرات المتكونة على الطبق. وبالنسبة لكل تخفيف، يمكن التعرف على مستعمرات animo من خلال لونها البيج المميز، ومناطق تحلل ألفا (alpha hemolysis) المحيطة بها، وهي عبارة عن هالات صغيرة حول كل مستعمرة ناتجة عن هضم البكتيريا لمكمل الدم الموجود في الآجار.

وأخيراً، من خلال منخفضات صغيرة في مركز كل مستعمرة تمنحها مظهر خلية دم حمراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم راسخ لكيفية إنشاء استعمار أنفي بلعومي في الفأر، وكيفية عزل البكتيريا والخلايا من البلعوم الأنفي للفأر بعد الاستعمار باستخدام الغسيل الأنفي، وكيفية تقدير الحمل البكتيري المقابل باستخدام التقنيات الميكروبيولوجية. نأمل أن تشجعك الطرق الموصوفة في هذا الفيديو على استخدام نموذج استعمار داخل الأنف لدراسة استجابات المضيف لمسببات الأمراض في سياق هذه المنطقة التي لم تنل قسطاً كافياً من الدراسة.