تقرير من الأحماض الدهنية المسموح وتركيزات ذيفان الكوليرا عن طريق خلايا الإنسان الظهارية في الأمعاء وBALB / ج الضامة ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تركيزات الأحماض الدهنية وذيفان الكوليرا التي يمكن تحملها والتي لا تؤثر سلبًا على بقاء الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنمية النوع المناسب من الخلايا، ثم تتمثل الخطوة الثانية في تحضين الخلايا مع تركيزات متفاوتة من الأحماض الدهنية الثلاثة المراد اختبارها أو مع ذيفان الكوليرا.

بعد مرور 24 ساعة، يتم تقييم بقاء الخلايا حية باستخدام مقايسة MTT. وفي النهاية، تُظهر بيانات القياس الطيفي الناتجة عن مقايسة MTT التركيزات المثلى للأحماض الدهنية وذيفان الكوليرا التي يمكن معالجة الخلايا بها دون حدوث انخفاض ملحوظ في معدل البقاء. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو الوقاية من عدوى الكوليرا نظرًا لأن التطعيمات لا تنجح دائمًا.

ستُستخدم خلايا البلعمة من فئران Bowel C من نوع Moose musculus لجميع تقديرات السموم المشتركة ولتقدير تركيز الأحماض الدهنية على نطاق أوسع، حيث يتم إكثار الخلايا في أحد وسطين: DMEM مع L glutamine مضاف إليه 10% fetal bovine serum و1% antibiotic antimycotic، أو وسط RPMI 1640 الأساسي مضاف إليه 10% fetal bovine serum و5% L-glutamine و1% antibiotic antimycotic. لهذا البروتوكول، تُنمّى خلايا Bowel C في دوارق Corning مربعة بحجم 75 سنتيمتر ذات أغطية مهواة عند 37 °C، و95% هواء و5% carbon dioxide. ولتقدير تركيز الأحماض الدهنية على نطاق دقيق، تُستخدم خلايا طلائية معوية بشرية مُكثّرة في دوارق Corning مربعة بحجم 75 سنتيمتر ذات أغطية مهواة في وسط hypercare مضاف إليه 10% FPS و30 nanograms per milliliter.

لا تستخدم كواشف المضادات الحيوية والمضادات الفطرية مع EGF البشري وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، وتُحضن الخلايا عند 37 °C في جو يحتوي على 95% هواء و5% ثاني أكسيد الكربون. يتم إجراء الاستزراع الفرعي لجميع الخلايا بنسبة من واحد إلى ثلاثة عند وصول درجة التلاقي (confluency) إلى 70% تقريباً، اعتماداً على نوع الخلايا، وعادةً ما يتم الاستزراع الفرعي كل يومين إلى خمسة أيام قبل المعالجة بالأحماض الدهنية. لتحضير الأحماض الدهنية، يتم أولاً نقل أحماض oleic وlinoleic وlinoleic من الأمبولات الزجاجية المقدمة من الشركة إلى قوارير زجاجية معقمة. بعد ذلك، يتم نقل كل حمض دهني إلى أنبوب إبندورف (eppendorf tube) معقم ومنفصل.

أذب كل حمض دهني في Ethanol بتركيز 100% بتخفيف بنسبة واحد إلى ستة، متبعاً ذلك بإضافة RPMI 1640. وسيط غير مكتمل وصولاً إلى تركيز نهائي قدره 10 micrograms لكل µL. قم برج كل محلول باستخدام جهاز الـ Vortex وانقلها إلى قوارير زجاجية للتخزين في مجمد درجة حرارة -20 °C.

زراعة خلايا ظهارية معوية بشرية بكثافة 2,500 خلية لكل بئر في أطباق زراعة الأنسجة ذات 96 بئراً، مع إضافة الوسط الغذائي الكامل المناسب لرفع الحجم الإجمالي في كل بئر إلى 200 µL. تُحضن الخلايا عند 37 °C، وفي جو يحتوي على 95% هواء و 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

بعد فترة تكاثر تستغرق 24 ساعة، قم بإزالة الوسط. أضف التركيزات المناسبة من كل حمض دهني سيتم اختباره إلى الآبار كعنصر تحكم إيجابي. قم بحضن الخلايا مع وسط كامل كعنصر تحكم سلبي، واحضن الخلايا مع 70% ethanol.

بعد ذلك، أضف وسطاً غذائياً كاملاً لإيصال الحجم الإجمالي لكل بئر إلى 200 µL. تُحضن الأطباق المعالجة لمدة 24 ساعة قبل البدء في مقايسة MTT لتهيئة سم الكوليرا لمعالجات الخلايا. قم بإذابة سم الكوليرا في PBS بتركيز 1 mg/mL.

قم بتجزئة المحلول في أنابيب حفظ بالتبريد (cryo vials) وخزنه في درجة حرارة تتراوح بين 2 و 8 درجة مئوية قبل معالجة الخلايا. خفف السم بنسبة 1:100 إما في محلول PBS المعقم أو في وسط DMEM غير مكتمل للوصول إلى تركيز عمل نهائي قدره 1 ng/µL لكل لوحة. يتم توزيع البلاعم (Macrophages) بمعدل 2,500 خلية لكل بئر في لوحة 96 بئراً.

تُحضن أطباق زراعة الأنسجة ذات الآبار عند 37 درجة Celsius، وفي جو يحتوي على 95% هواء و5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. وبعد انتهاء فترة التكاثر التي تستغرق 24 ساعة، يُزال الوسط المادي وتُضاف تركيزات الاختبار المناسبة من ذيفان الكوليرا إلى الآبار. وبشكل مماثل لمعاملات الأحماض الدهنية، تُحضن الخلايا مع وسط كامل كعينة ضابطة موجبة، و70% ethanol كعينة ضابطة سالبة لجميع العينات والمعاملات.

استخدم ثلاث مكررات كحد أدنى، مع زيادة عدد المكررات للمجموعات الضابطة الموجبة. أضف وسطاً غذائياً كاملاً لرفع الحجم الإجمالي لكل بئر إلى 200 microliters. قم بحضن الأطباق المعالجة بـ cholera toxin لمدة 24 ساعة قبل البدء في مقايسة MTT.

بعد مرور 24 ساعة من معالجة الخلايا إما بالأحماض الدهنية أو بالـ color toin، يتم تحديد حيوية الخلايا باستخدام مقايسة MTT. قم بإزالة المحلول من كل بئر في لوحة الـ 96 بئراً المراد اختبارها واستبدله بـ 200 microliters من محلول وسط غذائي كامل وجديد.

أضف 10 µL من محلول MTT بتركيز 2.5 mg/mL المُحضّر حديثاً إلى كل بئر. حضّن الطبق عند 37 °C لمدة تتراوح بين ثلاث إلى أربع ساعات. بعد مرور ثلاث إلى أربع ساعات، تخلص من المحلول الوسط وأضف 100 µL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.04 M في الإيزوبروبانول إلى كل بئر.

قم بحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، انقل المحلول من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 20,000 ×g لمدة دقيقة واحدة أو حتى تتكون كريّة. انقل ما بين 20 و 40 µL من كل عينة إلى قارئ الأطباق الدقيقة واقرأ الامتصاصية عند 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

يوضح هذا الشكل بقاء معظم الخلايا البلعمية كدالة للضابط الموجب للمعالجات التي تستخدم تركيزات متزايدة من حمض oleic، وحمض linoleic، وأحماض linoleic. ومن الواضح أن الخلايا لا تتحمل التركيزات التي تتجاوز 100 nanograms per microliter لأي من الأحماض الدهنية. وقد كُررت التجربة باستخدام خلايا ظهارية بشرية لتركيزات أقل من 100 nanograms per microliter بزيادات قدرها 10 nanogram per microliter، وصولاً إلى 70 nanograms per microliter.

يوضح هذا الرسم البياني بقاء الخلايا لكل تركيز من حمض الأوليك. وقد أشار تحليل التباين أحادي الاتجاه (One way ANOVA) إلى أن واحداً أو أكثر من المتوسطات كان مختلفاً من الناحية الإحصائية. ومع ذلك، فإن المعاملات ذات التركيزات الأعلى فقط هي التي أدت إلى متوسطات مختلفة إحصائياً عن متوسط المجموعة الضابطة الموجبة.

ومن المثير للاهتمام أن الاختلافات الملحوظة كانت تعود إلى زيادة في حيوية الخلايا مع تباين أكبر. وقد تم الحصول على نتائج مماثلة لأحماض linoleic و linoleic. بطريقة واحدة.

أشار تحليل التباين (Anova) إلى أن جميع متوسطات العلاج لم تكن مختلفة إحصائيًا عن متوسط المجموعة الضابطة الموجبة، ولكن يبدو أن التباين يزداد في بعض التركيزات الأعلى، مثل 60 nanograms per microliter من حمض linoleic acid أو linoleic acid بناءً على هذه النتائج. ويبدو أن التركيزات المثلى للأحماض الدهنية عند استخدام الخلايا الظهارية المعوية البشرية تتراوح بين 1 و5 nanograms per microliter. كما تم اختبار تأثيرات التركيزات المتفاوتة من سم collar toxin على بقاء معظم الخلايا البلعمية باستخدام علاجات لمستويات السم بزيادات كبيرة نسبيًا.

لُوحظ اتجاه تنازلي في حيوية الخلايا، حيث تباينت الحيوية المتوقعة للخلايا بشكل كبير لكل معالجة. وقد أدى هذا التباين الكبير في الحيوية إلى عدم وجود فرق معنوي بين متوسط الضابط الموجب وأي من المعالجات، مما استدعى إجراء المزيد من الاختبارات على مستويات سموم تبلغ 100 nanograms أو أقل. يوضح هذا الرسم البياني حيوية الخلايا لمعالجات مستويات السموم المنخفضة.

تتفاوت حيوية الخلايا بشكل كبير لمعظم تركيزات السموم، على الرغم من ملاحظة زيادات طفيفة في الحيوية نتيجة للمعالجات. وهذه الزيادات ليست ذات دلالة إحصائية لأي من المعالجات مقارنة بمتوسط المجموعة الضابطة الموجبة. وبناءً على هذه النتائج.

التركيز الموصى به لسم الكوليرا هو أقل من 30 nanograms لكل معالجة عند استخدام البلاعم المشتقة من نخاع العظم لفئران C بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث الكوليرا لاستكشاف ما إذا كانت الأحماض الدهنية يمكن أن تعزز المناعة ضد العدوى بـ Vio cholera.