Optogenetic اضطراب النشاط العصبي مع إضاءة الليزر في شبه سليمة

في هذا البروتوكول، نبدأ بتغذية يرقات ذات نمط جيني مناسب بغذاء يعتمد على E ويحتوي على جميع trans A TR. يتم تثبيت كل يرقة وتشريحها في محلول ملحي طبيعي، ثم يُستبدل المحلول الملحي الطبيعي بـ 2 mL من محلول رينجر الكالسيوم، وتوضع تحضيرة LABA على منصة المجهر. يتم تسجيل حركة LABA المشرحة بالفيديو باستخدام كاميرا CCD. ومن خلال تسليط الضوء على الجهاز العصبي محلياً، يمكننا تحفيز النشاط العصبي لمجموعة فرعية من الخلايا العصبية في توقيت محدد مع مراقبة حركة التحضيرة نفسها.

مرحباً، أنا Tega من مختبر Dr.A. ومرحباً، أنا Hi Kosaka، وأعمل أيضاً في مختبر dr. A بمستوى Oph.

تُعد الحركة نظاماً نموذجياً مفيداً لدراسة الدوائر الحركية. وبفضل التقنيات الجينية المتقدمة للغاية في هذا البروتوكول، سنقوم بالتلاعب البصري الوراثي بالعصبونات الحركية مع مراقبة مستوى الحركة. ومن خلال استخدام الليزر في المجهر البؤري، يمكن تحفيز مجموعة فرعية من العصبونات وتحليل الاستجابات الحركية تجاه الاضطراب الزماني والمكاني لهذه العصبونات.

لنبدأ الآن. قم بالحفاظ على سلالات الذباب من نوع K six G four US CHR two، أو K six G four US NPHR في أوعية حيوية بلاستيكية تحتوي على غذاء حي قياسي. أضف محلول TL إلى وسط قائم على الخميرة بالتراكيز المناسبة وامزجه جيداً، ثم قم بفرد وسط الخميرة على طبق آغار بعصير التفاح.

انقل المزرعة الثانية أو الثالثة في SLA من القوارير. ضع العينة على طبق يحتوي على وسط غذائي للخميرة مع TR. غطِّ الطبق بورق الألومنيوم للحفاظ على TR في الظلام. قم بتنمية العينة عند 25 degrees C لفترة زمنية مناسبة.

هذه كاميرا CCD لتصوير العينات المخبرية السليمة. قم بتوصيل كاميرا CCD بمجهر بؤري تقليدي باستخدام وصلة SEMA. خذ أجزاء A TRA lobby واشطفها بالماء.

لإزالة بقايا الطعام من الجسم، ضع اليرقة على طبق التبريد C guard بحيث يكون الجانب الظهري للأسفل. قم بتثبيتها باستخدام دبابيس الحشرات من جهتي الرأس والذيل. أضف محلول ملحي طبيعي خالٍ من الكالسيوم.

أحدث شقاً صغيراً بالقرب من الذيل باستخدام مقص دقيق. قم بإجراء قطع طولي على طول الخط الناصف الظهري. توخ الحذر لتجنب إتلاف الحبل العصبي البطني والأعصاب الطرفية.

قم بإجراء شق جانبي صغير باستخدام دبوس الرأس عند كل زاوية من زوايا جدار الجسم الذي تم تشريحه. قم بإزالة الأعضاء الداخلية باستثناء الدماغ والحبل العصبي البطني. استبدل المحلول الملحي العادي بمحلول رينجر بالكالسيوم لنموذج 2 مليون.

قم بتركيب عدسة شيئية جافة ذات قوة تكبير كاملة في المجهر البؤري (confocal microscope)، وضع العينة المختبرية على منصة المجهر. احصل على صورة نفاذية للعينة المشرحة باستخدام ليزر أحمر لتحديد موقع الحبل العصبي البطني بواسطة المجهر البؤري. حدد منطقة الاهتمام (region of interest) في صورة النفاذية، حيث يكون تكبير القالب مفيداً في تحديد منطقة الاهتمام المحددة.

قم بتغيير مجموعة المرشحات في المجهر للإضاءة بضوء طوله الموجي 488 nanometer أو 559 nanometer. قم بمعاينة جدار الجسم عن طريق إضاءة العينة باستخدام مصباح الهالوجين. راقب العينة بواسطة كاميرا CCD متصلة بالمجهر البؤري (confocal microscope).

استرجع حركة جدار الجسم وقم بتبديل شعاع الليزر فقط للتلاعب مؤقتاً بالأنشطة العصبية، بينما يتم رصد وتسجيل الحركة الدودية في نفس التحضير السليم بواسطة كاميرا CCD. يعبر هذا المختبر عن CHL two في العصبونات الحركية. يؤدي تسليط الضوء على قطعة واحدة أو قطعتين من الحبل العصبي البطني إلى تنشيط العصبونات الحركية في تلك القطع، مما يؤدي بدوره إلى تحفيز انقباض العضلات في قطع جدار الجسم المقابلة، وهو ما يحفز قطعاً أخرى في العصب البطني.

يؤدي البرد إلى انقباض قطع الجسم الأخرى. تم التعبير عن NPHL في العصبونات الحركية عند تحفيز بضع قطع من الحبل العصبي البطني باستخدام ليزر أصفر. وقد توقفت الموجة المنتشرة عند القطعة المقابلة من جدار الجسم.

ثم أعادت الموجة التشكل من الجزء المتوقف عند إيقاف تشغيل استئصال الليزر. يوضح هذا البروتوكول إجراء إجراء الاضطراب البصري الوراثي للنشاط العصبي باستخدام الليزر في نفس المستوى الدائري الخامل أثناء الحركة. يجب عدم إتلاف الحبل العصبي البطني والعصب الطرفي أثناء هذا التشريح لتحقيق التحفيز الكافي.

يجب ضبط قدرة الإضاءة عن طريق تغيير قدرة الليزر، أو سرعة المسح، أو عدد التكرارات في المجهر البؤري (confocal microscope). هذا هو البروتوكول بالكامل. شكراً لمشاهدتكم وبالتوفيق في تجاربكم.