ال في البيضة CAM-مقايسة باعتبارها Xenograftmodel عن الورم اللحمي

ال

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء غشاء مطعمي للكتكوت أو اختبار CAM لدراسة الساركوما أو الخلية أو سلوك الكسب غير المشروع. يتم تحقيق ذلك عن طريق عمل نافذة في قشرة البيضة أولا في يوم الحضانة الثالث. في الخطوة الثانية في يوم الحضانة التاسع ، يتم تحضير مادة الورم.

ثم بعد إزالة الطبقة الظهارية ، يضاف الورم إلى الكاميرا خلال الخطوة الأخيرة في يوم الحضانة 16 ، يتم تصوير الطب التكميلي والبديل وحصاده وتثبيته في الفورمالين للتقييم النسيجي. في النهاية ، يتم استخدام الأنسجة الكلاسيكية h و d والكيمياء المناعية لإثبات الساركوما وتكاثر الخلايا وغزو الأوعية الدموية وتفاعلات المضيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل معظم النماذج xenograft ، هي أنها سهلة التعلم ورخيصة نسبيا.

كما يسمح لك بدراسة عدد لا يحصى من الأنشطة المرتبطة بالورم الخبيث في فترة زمنية قصيرة جدا ، ولا يتطلب لجنة أخلاقية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الساركوما ، مثل تأثير تفاعلات مضيف الورم على بقاء الورم ، وإعادة تكوين البيئة المكروية للورم ، وتجنيد خلايا السدى. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج الشخصي للساركوما حيث يمكن دراسة مادة المريض الخاصة.

كل هذه التقنية الجديدة يمكن أن توفر لنا رؤى جديدة حول تكوين الخلايا العصبية المعدل النوعي. كما أنه قابل للتطبيق بشكل كبير على الأنظمة الأخرى مثل تكوين الأورام بشكل عام. ابدأ باستخدام مشرط معقم لتقطيع عينة الورم إلى قطع صغيرة ، لا يزيد حجمها عن ملليمتر مكعب واحد ، وإزالة جميع المناطق المتكلسة.

ثم قم بوزن العينة ونقل جرامين إلى أربعة جرامات من الأنسجة إلى أنبوب منفصل. هضم الأنسجة في 2.5 مل من الكولاجيناز اثنين و 2.5 مل من محاليل DN a. بعد معالجة الأنسجة ، وفقا لبروتوكول الورم H للتفكك ، قم بتصفية المعلق الناتج من خلال مصفاة خلية 150 ميكرون.

الآن الطرد المركزي التعليق بقوة طرد مركزي مناسبة ، مثل 100 إلى 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة ، احتضن الحبيبات في 10 مل من تحلل كريات الدم الحمراء ، وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة مع التعليق العرضي. بعد 10 دقائق ، أضف 25 مل من وسط الثقافة لإيقاف التفاعل بعد تدوير التعليق مرة أخرى ، يجب أن تكون الحبيبات بيضاء ، وتخلص من المادة الطافية وأضف خمسة ملليلتر من الوسط إلى الخلايا ، ثم قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون.

استخدم عداد الخلايا التلقائي لتحديد عدد الخلايا الحية لكل مليلتر عند التطور. في اليوم الثالث ، أدخل إبرة قياس 18 في طرف البويضة وقم بإزالة ملليلترين من الألبومين لخفض مستوى OVO chorio جميع غشاء أو كام. الآن قم بتطبيق فيلم لاصق شبه منفذ على الجانب العلوي المحدد من الغلاف لمنع انسكاب جزيئات القشرة على الكاميرا أثناء قطع النافذة.

ثم قم بعمل ثقب مقدمة مع كل شيء صغير على سطح البيضة. يعد عدم إتلاف الكاميرا أثناء فتح الغلاف أصعب جزء من الإجراء. نستخدم مقصا حادا يمسكها أفقيا بيد مع الاحتفاظ بالبيضة في اليد الأخرى.

الآن ، استخدم زوجا من المقصات الجراحية المدببة المعقمة والحادة لقطع نافذة مربعة بطول سنتيمتر واحد في القشرة. يجب أن يكون القلب النابض والأوعية المجاورة للجنين مرئية الآن على سطح صفار البيضة. قم بإزالة أي بويضات غير مخصبة أو أجنة ميتة.

ثم أغلق النافذة بغشاء لاصق أكثر شبه نفاذة. بعد تدوير تعليق الورم مرة أخرى ، أعد تعليق الحبيبات في هلام مصفوفة خارج الخلية المبرد مرة واحدة 10 إلى ست خلايا لكل 100 ميكرولتر من الجل. احتفظ بهذا المحلول على ذوبان الجليد.

بعد ذلك ، تحت التدفق الرقائقي ، استخدم زوجا من المقصات الجراحية المعقمة لاستئصال جزء من الفيلم اللاصق شبه النفاذ. قم بإزالة طبقة الخلية الظهارية عن طريق لمس الكاميرا برفق باستخدام قضيب زجاجي معقم. ثم أضف 4 قطرات 25 ميكرولتر من تعليق هلام ECM الخلوي إلى الكاميرا ، مما يسمح لهلام ECM بالبلمرة بين التطبيقات.

بهذه الطريقة ، يتم إنشاء لوحة ملتصقة تحتوي على الخلايا السرطانية. ثم أغلق نافذة الغلاف مرة أخرى بغشاء لاصق شبه منفذ. بعد فترة الحضانة التجريبية المناسبة ، استخدم مقصا جراحيا لتكبير نافذة القشرة ، مع التأكد من عدم القطع المنخفض جدا.

بعد ذلك ، استخدم ماصة لإضافة 300 إلى 500 ميكرولتر من PBS إلى قسم CAM الذي يحتوي على المادة الملقحة. ثم قم بتصوير الكاميرا من خلال مجهر مضان ستيريو. بعد ذلك ، استخدم زوجا من المقصات المعقمة لقطع الغشاء عند الحدود الملقى على القشرة ووضع الكاميرا المحصودة في طبق بتري معقم مليء ب PBS أو الفورمالديهايد المخزن مؤقتا.

ثم قم بتصوير الجانبين العلوي والسفلي للكاميرا ، مع وبدون مرشح كما هو موضح. في هذا الشكل الأول ، تصبح ترقيع الورم ملتصقة بالكام. هنا ، يمكن ملاحظة تعليق خلية واحدة من مادة المريض تعرض لوحة مجففة ومرتفعة قليلا في هاتين الصورتين.

يظهر التجاعيد الملحوظة للغشاء التي تحدث بعد استئصال الكاميرا. يشكل الخط الثنائي SAO لوحة منتشرة فوق CAM مع زيادة واضحة للسطح من اليوم السابع. بعد التلقيح ، تظل إشارة GFP قوية مما يشير إلى الخلايا القابلة للحياة.

تظهر هذه اللويحات التي تحتوي على خلايا SW 1 3 53 انخفاضا في السطح وتميل إلى أن يكون لها كامة متقلصة ، مما ينتج عنه غشاء مجعد. بعد الحصاد من اليوم السابع ، يلاحظ النزيف بشكل متكرر. تنخفض إشارة DSR عندما يصبح مسبار الفلورسنت مخففا بعد العديد من الانقسامات الخلوية ، وكذلك في حالة حدوث نزيف.

في معظم الحالات ، لوحظ تفاعل الأوعية الدموية ل CAM عندما تدخل الأوعية الملتوية الجديدة العينة. على سبيل المثال ، يمكن أيضا ملاحظة التفرع كما هو موضح في رؤوس الأسهم ومفاغرة كما هو موضح في العلامات النجمية في هذا النزيف النقطي كما هو موضح في الأسهم ، في جميع أنحاء اللوحة. لاحظ هجرة SAOs خليتين موازيتين لأوعية الكاميرا.

يمكن تصور رد الفعل الوعائي هذا بعد استئصال الكاميرا في المنظر السفلي الذي يظهر الأوعية الملتوية المحيطة بالكسب غير المشروع أو البلاك. لوحظ تفاعل الأوعية الدموية ل CAM في مجموعة الكسب غير المشروع للورم ومجموعة تعليق الخلية الواحدة. تظهر الأدلة النسيجية أن خليتين من SAOs تحافظان على مظهر خلية واحدة في جميع أنحاء الحجم الكامل لهلام المصفوفة خارج الخلية مما يتسبب في زيادة سمك وقطر البلاك.

تغزو الخلايا السرطانية طبقة الأديم المتوسط للكام كما هو موضح هنا بالسهم ، وبالتالي تكبير المسافة بين الأديم الباطن والطبقات الجلدية للكام مثل سحاب الفتح. كما هو موضح في السهم المزدوج ، فإن نمط نمو خلايا SW 1 3 5 3 وتعليق خلية واحدة من الساركوما الواعية للمريض أكثر تجمعا مع جزر من الخلايا في مساحة من هلام المصفوفة خارج الخلية. كما هو موضح في السهم ، دون تحمل موقع النمو خارج الرحم ، وجدنا أن السمات الأساسية والخصائص الكيميائية المناعية لأورام الساركوما الأصلية قد تم الحفاظ عليها في الكاميرا.

بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت ترقيع الورم قابلة لإعادة التوعي كما يتضح من ظهور كريات الدم الحمراء ذات اللون الأزرق الوردي الداكن كما هو موضح في رؤوس الأسهم والموجودة في الأوعية الدموية ، حيث يظهر عد الخلايا KI 67 الإيجابية و KI 67 السلبية زيادة مطردة في العدد الإجمالي للخلايا من اليوم الرابع لكلا خطي الخلايا. بعد هذا اليوم ، يظل العدد الإجمالي للخلايا مستقرا بعد سبعة أيام من التلقيح ، ويبدأ عدد الخلايا الإيجابية KI 67 ويبدأ العدد الإجمالي للخلايا في الانخفاض. لوحظت نسبة أكبر من الخلايا الإيجابية KI 67 بالقرب من الكاميرا ولوحظت نسبة أكبر من الخلايا السالبة KI 67 على سطح البلاك.

بمجرد أن يصبح الماجستير ، يمكن استخدام تقنية cam SA لتحليل 50 × في 14 ساعة موزعة على ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يمكن إجراء تلطيخ وتقييم إضافي ويتطلب ثلاث ساعات لكل 10 شروط باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق إضافية مثل تصوير نمط الحياة من أجل معالجة مشكلات إضافية مثل تسرب الخلايا السرطانية أو تسمية الأنفلونزا.

لذلك من خلال تطوير هذه التقنية الجديدة ، فإنها تسمح للباحثين في مجال الاختبارات قبل السريرية باستكشاف عوامل تنبؤية وعلاجية جديدة في مرضى الساركوما. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق مادة الورم في cmaa وكيفية ترجمة ملاحظاتك المجهرية والمجهرية نحو فهم أفضل لتفاعلات مضيف الورم.