زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات
يناير 20, 2014
الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من السلف العضلية واعدة المرشحين لاستراتيجيات العلاج بالخلايا لعلاج خلل العضلات. يصف هذا البروتوكول الزرع والقياسات الوظيفية المطلوبة لتقييم النغر والتمايز بين الخلايا الميوانجيوائية المشتقة من iPSC (نوع من السلف العضلي) في نماذج الماوس لتجديد العضلات الحاد والمزمن.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الإمكانات العضلية لأسلاف العضلات المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في نماذج الفئران لتجديد العضلات الحاد والمزمن. يتم تحقيق ذلك عن طريق تقييم إمكانات عضل الخلايا في المختبر أولا. الخطوة الثانية هي زرع الخلايا عن طريق الحقن العضلي.
بدلا من ذلك ، يتم حقن الخلايا في الشريان الفخذي عن طريق إجراء جراحي مجهري. الخطوة الأخيرة هي تقييم التحسين الوظيفي للنمط الظاهري الضمور للحيوانات المعالجة. في النهاية ، يتم استخدام فحوصات التألق المناعي والأنسجة لإظهار النقش والمساهمة الوظيفية للخلايا المانحة في العضلات المضيفة.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجديد العضلات الهيكلية ، مثل التحقيق في مناهج العلاج بالخلايا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج ضمور العضلات لأنها يمكن أن تمهد الطريق لاستراتيجيات العلاج بالخلايا الذاتية باستخدام أسلاف خلايا IPS DER. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية ، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل توصيل الجزيئات ، في العضل العضلي ، أو داخل العضلات ، والتحليل اللاحق للتأثير على وظيفة العضلات ومورفولوجيا.
حسنا ، كانت لدينا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن ثقافة IPSL يمكن أن توفر طريقة للتغلب على بعض قيود الخلايا الجذعية البالغة ، مثل التوافر من خزعات الأنسجة وإمكانية توسعها. ابدأ بتوليد خط خلوي مستقر من العناصر التي يتم تحويلها باستخدام ناقل محفز للتاموكسيفين يفرط في التعبير عن منظم تكوين العضل myo D. بعد الطلاء ب 1٪ ماتري جل وغسله بالبذور المتوسطة ، صفيحة مع الخلايا المنقولة وتحتضن عند 37 درجة مئوية في وسط النمو. يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء في غضون يوم أو يومين.
عندما يكونون جاهزين ، أضف ميكرومولار واحد لهيدروكسي تاموكسيفين في وسط النمو. بعد 24 ساعة ، استبدل وسط النمو بالتمايز. متوسط مكمل بميكرومولار واحد لهيدروكسي تاموكسيفين.
افحص الثقافات يوميا بحثا عن تكوين أنبوب myo واستبدل نصف الوسط بتمايز جديد. وسط كل يومين عندما تكون الثقافات جاهزة. يتم استخدامها في فحوصات الزرع.
هنا ، يتم استخدام الفئران التي تعاني من ضمور ونقص المناعة لتحديد مدى النقش للزرع العضلي. عالج بحقن تاموكسيفين قبل 24 ساعة من الزرع. يجب أيضا معالجة الخلايا مسبقا بإضافة تاموكسيفين إلى وسط النمو في الليلة السابقة.
في يوم الزرع ، يتم فصلها عن طريق التربسين والعد والطرد المركزي ، تغسل الخلايا مرة واحدة في PBS قبل Resus ، معلقة في PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم إلى تركيز تميل إلى الخلايا الست لكل 30 ميكرولترا. بعد تخدير وتعقيم الجلد ، حدد موقع العضلة الأمامية للظنبوب. حدد نقطة إدخال الوتر القريب وأدخل الإبرة.
تلميح ملليمترين تحت هذه النقطة. أدخل خمسة ملليمترات من الإبرة عند منحدر 15 درجة بالنسبة إلى الساق وحقن تعليق الخلية ببطء أثناء سحب الإبرة. أفرغ المحقنة مع ملليمترين من الإبرة لا تزال داخل العضلات.
توخ الحذر عند إزالة الإبرة من العضلات لتجنب انسكاب تعليق الخلية عبر مسار الإبرة. باتباع هذه الإجراءات نفسها ، يتم إجراء حقن فقر الدم المعدي على بعد ملليمترين فوق تقاطع الوتر العضلي لوتر العرقوب وعضلات الفخذ. يتم إجراء حقن Femme على بعد ملليمترين فوق الوتر البعيد للزرع داخل الشرايين.
عالج والخلايا بعقار تاموكسيفين كما هو موضح سابقا. عندما تكون جاهزة للزراعة ، يتم تحضير الخلايا كما هو موضح سابقا ، باستثناء أنها يتم ترشيحها قبل الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم وأضف 10٪ صبغة زرقاء براءة اختراع للسماح بتصور توزيع تعليق الخلية.
قمبإعادة تعليق الخلايا في المحقنة بعناية وإزالة جميع فقاعات الهواء قبل الحقن ، وبعد التخدير ، حلق وتطهير المنطقة كما هو موضح ، وقم بعمل شق من خمسة إلى سبعة ملليمترات وقم بتحديد موقع حزمة الفخذ. قم بإزالة اللفافة الضامة التي تغطي الحزمة برفق بالملقط. بعد ذلك ، افصل بعناية الوريد الفخذي والعصب عن الشريان عن طريق إدخال طرف الملقط بينهما برفق وعن طريق توسيع الثقب تدريجيا.
الوريد الفخذي هش. احرص على عدم قرصه أثناء انفصاله عن الشريان الفخذي. بمجرد الانفصال ، ارفع الشريان بطرف واحد من الملقط وقم بتثبيت الشريان بالطرف الآخر.
باستخدام إبرة 30 جم ، قم بثقب الشريان وحقن 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في اتجاه مجرى المنطقة المثبتة بسرعة تسريب تبلغ حوالي خمسة ميكرولتر في الثانية. قم بإزالة الإبرة والملقط ببطء من الشريان لاستعادة تدفق الدم إلى الطرف. اضغط بشاش معقم لتجنب النزيف و / أو الكي حسب الحاجة.
تسمح الصبغة الزرقاء السالكة بالتعرف الفوري على الحقن الموضوع بشكل صحيح ، إذا تم حقنها بشكل صحيح ، فسوف يتحول الطرف بأكمله بسرعة إلى اللون الأزرق الفاتح ، ويخيط الجرح ويراقب حتى تتعافى. قم بإدارة التسكين لمدة ثلاثة أيام وفحص الجرح يتم تقييم التغييرات اليومية في القدرة الحركية للفئران المعالجة من خلال اختبار جهاز المشي. تبدأ قياسات خط الأساس قبل شهر تقريبا من العلاج وتستخدم لتقييم تحسن كل تم اختباره.
الخطوة الأولى هي تأقلم مع التمرين قبل الاختبار. للقيام بذلك ، اضبط جهاز المشي بسرعة ستة أمتار في الدقيقة لمدة 10 دقائق. كرر هذا الإجراء كل يومين لمدة أسبوع واحد.
بمجرد أن يصبحوا على دراية بالجهاز ، اضبط المنحدر على 10 درجات وضع في ممرات جهاز المشي. قم بتشغيل جهاز المشي بسرعة تبدأ من ستة أمتار في الدقيقة. ادفع برفق أي غير راغب في بدء التمرين.
بعد ذلك ، ابدأ المؤقت وقم بزيادة السرعة بمترين في الدقيقة كل دقيقتين بمجرد أن يستلقي في منطقة الراحة لأكثر من خمس ثوان. دون محاولة إعادة تعشيق جهاز المشي ، المسها برفق بعصا لتحفيز إعادة تشغيل التمرين. يعتبر الفأر مرهقا عندما يستلقي في منطقة الراحة لأكثر من خمس ثوان دون محاولة إعادة تعشيق جهاز المشي.
بعد سلسلة من ثلاثة محفزات ميكانيكية متتالية ، واحدة كل خمس ثوان ، سجل أداء كل وكرر القياسات أسبوعيا أو كل 10 أيام لثلاث مرات على الأقل. بدءا من أسبوعين بعد زرع الخلايا. كرر نفس الإجراء في الفئران المعالجة بعد الاختبار.
استخدم المقارنات مع خط الأساس لتقييم التغيرات في الأداء. بعد 48 ساعة من إعطاء هيدروكسي تاموكسيفين ، يمكن التعرف على النوى الموجبة في العناصر المنقولة في المزرعة. كما هو موضح هنا.
بعد أسبوع ، تندمج الخلايا وتتمايز إلى أنابيب عضلية متعددة النوى. عند زرعها في العضل في نموذج انعكاس لإصابة العضلات الحادة ، تساهم العناصر في نتائج تجديد الأنسجة من جهاز المشي. يظهر اختبار تحمل التمرين تحسنا في القدرة الحركية للفئران المعالجة بعد الزرع.
تظهر تحليلات خارج الجسم الحي للعضلات المزروعة مناطق إيجابية ل GFP تمثل مدى استعمار IMS في الأنسجة المضيفة ، مما يدل على أن الخلايا المانحة تزرع في العضلات الضمورية. الأهم من ذلك ، أن الخلايا المزروعة قادرة على التمايز في الجسم الحي لتشكيل ألياف عضلية هيكلية جديدة. يوضح هذا المثال تعبير ألفا ساركو جليكان من ims المصححة وراثيا إلى ألفا ساركو جليكان الفئران البيج الفارغة.
كشف تلطيخ Massen tri chrome عن انخفاض في كمية الأنسجة الليفية في العضلات المعالجة. باتباع هذا الإجراء في طرق مثل اختبار FreeWheel ، يمكن إجراء اختبار Evan Blue Diop وميكانيكا الألياف المفردة أو العضلات الكاملة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول التحسن في القدرة الحركية الطوعية وهشاشة الألياف والقوة المحددة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم قدرة تمايز العضلات وإمكانات الكسب غير المشروع والفعالية الوظيفية للأسلاف العضلية المشتقة من خلايا IPS باستخدام فحوصات في المختبر وفي الجسم الحي وخارج الجسم الحي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول تقييم الإمكانات الميوجينية للخلايا السلفية العضلية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSC) في نماذج الفئران لتجديد العضلات. يتضمن ذلك تقنيات الزرع والتقييمات الوظيفية لقياس الالتئام والتمايز.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- تجديد العضلات
- العلاج الخلوي
الخلفية
- يمكن أن تختلف الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
- الخلايا السلفية الميوجينية المستمدة من iPSCs واعدة لعلاج اعتلالات العضلات.
- فهم الالتئام والمساهمة الوظيفية أمر بالغ الأهمية للتطبيقات العلاجية.
- تركز هذه الدراسة على نماذج تجديد العضلات الحادة والمزمنة.
هدف الدراسة
- لتقييم الإمكانات الميوجينية للخلايا السلفية العضلية المستمدة من iPSC.
- لتقييم فعالية طرق الزرع.
- لتقييم التحسن الوظيفي في نماذج الفئران المعتلة عضليًا.
الطرق المستخدمة
- تقييم in vitro للإمكانات الميوجينية للخلايا المستمدة من iPSC.
- حقن الخلايا داخل العضلات لزرعها.
- حقن جراحي دقيق عبر الشريان الفخذي كطريقة بديلة.
- اختبارات المناعة المذهبية والأنسجة للتقييم الالتئام والوظيفة.
النتائج الرئيسية
- الالتئام الناجح للخلايا السلفية العضلية المستمدة من iPSC في عضلات العائل.
- تحسن وظيفي للنمط العضلي المعتل الملاحظ في الحيوانات المعالجة.
- أكدت التحليلات النسيجية تمايز الخلايا المانحة واندماجه.
- ترتبط التقييمات in vitro بنتائج in vivo.
الاستنتاجات
- تظهر الخلايا السلفية الميوجينية المستمدة من iPSC وعدًا لعلاجات تجديد العضلات.
- تعزز طرق الزرع بشكل فعال إصلاح العضلات في النماذج المعتلة عضليًا.
- تحتاج الدراسات الإضافية إلى تحسين البروتوكولات للتطبيقات السريرية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables preclinical evaluation of iPSC-derived myogenic progenitors for muscular dystrophy therapies, addressing the critical need for autologous cell sources with defined differentiation and engraftment potential. By integrating in vitro myogenic potential assessment with intramuscular and intra-arterial transplantation in acute and chronic mouse models, the method supports target validation and mechanistic de-risking of stem cell-based approaches. Functional readouts such as treadmill performance and histological engraftment provide quantitative, translatable endpoints for go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis of iPSC-derived mesoangioblast-like progenitors in skeletal muscle regeneration.
- Operational Value: Enables functional target validation through MyoD overexpression and tamoxifen-inducible systems to enhance myogenic differentiation.
- Predictive Value: Correlates in vitro myotube formation with in vivo engraftment and functional amelioration, supporting predictive confidence in progenitor efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized differentiation assays using immunofluorescence and histology to quantify myogenic potential prior to transplantation.
- Reproducibility: Defines cell preparation protocols (e.g., trypsin detachment, PBS resuspension, patent blue dye visualization) for consistent intramuscular and intra-arterial delivery.
- Scalability: Supports preparation of cell suspensions at controlled concentrations (10^6 cells/30 µL) for reproducible dosing across muscle groups.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Utilizes dystrophic and immunodeficient mouse models to model human muscular dystrophy pathology and assess regenerative potential.
- Translational Continuity: Links progenitor engraftment and differentiation to functional outcomes via treadmill testing, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Confirms in vivo myofiber formation and correction of biomarkers (e.g., α-sarcoglycan) in genetically corrected cells, reducing biological uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification of iPSC-derived progenitors through mechanistic validation and functional screening before IND-enabling studies.
- Discovery Biology: Tests progenitor myogenic potential via differentiation assays and transcriptional regulation (MyoD/tamoxifen) to clarify biological activity.
- Screening: Delivers quantitative engraftment and functional readouts (treadmill performance, histology) to compare progenitor batches or genetic modifications.
- Analytics: Employs immunofluorescence, histology, and functional exercise testing to generate multidimensional datasets for comparative analysis.
- Translational Research: Connects cellular engraftment to tissue-level repair and motor function recovery in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Provides a modular platform for evaluating various genetic corrections (e.g., lentiviral, HAC) or culture enhancements across multiple muscle injury models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of mechanistic ambiguity in progenitor function through correlated in vitro/in vivo validation.
- Operational Value: Standardization of transplantation routes (intramuscular, intra-arterial) and pretreatment protocols for reproducible engraftment assessment.
- Strategic Value: Informs capital-efficient go/no-go decisions by linking cellular potency to functional improvement in dystrophic phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of iPSC-derived progenitor lines based on engraftment efficiency and biomarker correction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, genetic modification (e.g., lentiviral transduction), and differentiation induction.
- Dependent on microsurgical injection capabilities for intra-arterial delivery and specialized treadmill systems for functional testing.
- Necessitates standardized pretreatment with tamoxifen for both cells and animals to induce MyoD expression.
- Requires histological and immunofluorescence infrastructure for engraftment and differentiation validation.
- Limited by murine model variability in dystrophy severity and immune status, which may affect engraftment reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
Assessment of Myogenic Potential
2:53
Transplantation in Mouse Models of Muscular Dystrophy
6:37
Outcome Measures on Transplanted Dystrophic Animals: Treadmill Test
8:15
Results: In vitro and In vivo Differentiation and Motor Capacity after Transplantation
9:24
Conclusion
