عزل الخلايا العصبية الحسية من Aplysia californica للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا العصبية الحسية الفردية للبليجة في الثقافة قصيرة المدى. بالنسبة لدراسات مشبك التصحيح ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح العقد التي تحتوي على خلايا حسية من مخدر. الخطوة الثانية هي هضم العقد في محلول الإنزيم بين عشية وضحاها.

بعد ذلك ، يتم تشريح الخلايا العصبية الحسية ذات الأهمية من العقد المهضومة. الخطوة الأخيرة هي تفكيك أطباق الثقافة المحضرة للالتصاق بركيزة الثقافة بين عشية وضحاها. في النهاية ، يتم استخدام لقط الجهد لدراسة الجهد والتيارات الأيونية ذات البوابات الناهضة المعبر عنها في هذه الخلايا العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل تسجيل الخلايا في الموقع ، هي أن عزل الخلايا العصبية يسمح باستخدام تقنية لقط جهد قطب كهربائي واحد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد المجهول الرئيسي في مجال علم الأحياء العصبية aple ، مثل هوية التيارات الأيونية التي يتم تنشيطها بواسطة الناقلات العصبية المتورطة في التعلم والذاكرة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب حساسية الخلايا العصبية للهضم الأنزيمي والتشتت على أطباق الثقافة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن بعض التيارات الغلوتاميتية المهمة في التعلم والذاكرة ستستفيد من عزل الخلية الذي توفره هذه الطريقة. سيظهر الإجراء طلاب الدراسات العليا ، آندي كيسيل وجوستين جرير. ابدأ هذا الإجراء بوضع جانب بطني للحيوان مخدر لأسفل في صينية التشريح.

قم بتثبيت من خلال حواف جدار الجسم والحدود شبه الخشبية ، ولكن تجنب الذيل والرأس لفضح السطح الظهري للأخدود التناسلي. بعد ذلك ، اشطف السطح الظهري بماء الصنبور البارد البطيء. ثم ضع تيارا خفيفا من كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ من زجاجة ضغط على طول الأخدود التناسلي وفوق الجزء العلوي من الرأس.

لعمل الشق الأولي ، أمسك بطية من الأنسجة بإحكام على يسار قاعدة الأخدود التناسلي باستخدام ملقط الأنف الضلعي أثناء قص ثقب ضحل على طول الطريق عبر المنطقة المسطحة الملساء لجدار الجسم على يمين الأخدود التناسلي باستخدام زوج من المقص بزاوية دقيقة. ثم قم بتوسيع الشق الأمامي إلى نقطة بين أربعة ROF مع السحب لأعلى باستخدام الشفرة السفلية لتجنب قطع القناة الهضمية. بعد ذلك ، استخدم ملقطا نظيفا ومقصا دقيقا لإزالة العقد في الرأس عن طريق قطع النقطة التي تتحول فيها الأعصاب المكونة للعقد الرئيسية إلى حلقة حول المريء من أجل إزالة البتلة الجنبية والعقد الدماغية كمجموعة.

بعد ذلك ، قم بإزالة العقدة الشدقية التي تلتصق بالجانب البطني من المريء. لعزل العقد ذات الأهمية ، قم بقص العقد الرئيسية بعيدا ، مع ترك طول الرابط المتصل بكل عقدة ذات أهمية يساوي قطر العقدة على الأقل. سيؤدي ذلك إلى تأخير الإنزيم من الإفراط في هضم الخلايا ذات الأهمية في الخطوة التالية.

ثم اشطف كل عقدة مستهدفة مرتين في أطباق من مياه البحر الاصطناعية باستخدام البنسلين ستربتومايسين. إذا كنت تستهدف الخلايا البلاستيكية ، اترك العقدة الجنبية اليمنى متصلة بالعقدة الهيمية البتلة اليمنى ، وبالمثل ، اترك العقدة الهيمي الجمعية اليسرى متصلة بالعقدة الهيمية البتلة اليسرى. ثم ضع العقد المغسولة في محلول الإنزيم وقم بتوصيل الغطاء بإحكام.

بعد ذلك ، ضع الأنبوب على جانبه على شاكر دوار واضبطه على سرعة بطيئة لمدة 13 إلى 15 ساعة طوال الليل عند حوالي 23 درجة مئوية. في هذا الإجراء ، املأ مركز الأطباق مقاس 35 ملم التي تم تغطيتها بالأشعة فوق البنفسجية وتعقيمها بالأشعة فوق البنفسجية بحوالي 0.5 ملم من مياه البحر الاصطناعية والستربتومايسين البنسلين لإنشاء جزيرة من الوسائط بالداخل. لتحضير التشريح الدقيق للعقد المهضومة ، اسكب محلول الإنزيم الذي يحتوي على دواسة الجنبة المهضومة والعقد الشدقية في طبق التشريح.

بعد ذلك ، ضع الطبق على مسرح المجهر على سطح أسود تحت الضوء المنعكس. بعد ذلك ، باستخدام النسيج الضام المرفق المثبت أسفل كل جانب ظهري من العقدة الجنبية لأعلى ، ستكون الأنسجة ناعمة وغير متسامحة مع التمدد. ثم اعزل الخلايا البلاستيكية من العقدة الجنبية باستخدام زوجين من الملقط مع الإمساك بدبوس تشريح دقيق مع أحدهما كمسبار.

استخدم المسبار لفصل هذه الخلايا عن البتلة ، الجمع ، الضام. ثم اترك مجموعة الخلايا تسقط في قاع طبق التشريح. انقل مجموعة الخلايا إلى طبق استزراع معد 35 ملم عن طريق امتصاص الكتلة برفق في طرف ماصة المراعي الزجاجية المصقولة قليلا التي تستخدم لمرة واحدة.

ثم قم بتوزيعها ببطء في جزيرة الوسائط في طبق ثقافة ، مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء في الماصة. كرر عزل مجموعة PVC للعقدة النسبية الأخرى وضعها في طبق ثقافة منفصل. فيما يلي صورة مجهرية لمجموعة خلايا PVC البرتقالية الداكنة على شكل حرف V من العقدة الجنبية اليمنى.

لتشريح الخلايا العصبية BSC. قم أولا بتثبيت العقدة الشدقية مع الجانب البطني لأعلى مع العناية لتجنيبها. تقوم الخلايا ذات الأهمية لاحقا بعزل خلايا BSC باستخدام زوجين من الملقط أثناء حمل دبوس تشريح دقيق مع أحدهما كمسبار.

بعد ذلك ، استخدم المسبار لفصل هذه الخلايا عن العقدة الشدقية. ثم اترك الخلايا تسقط في قاع طبق التشريح. يوضح هذا الرسم المجهري موقع الخلايا الجلوتاماتيرجية للعقدة الشدقية.

يمكن التعرف على الخلايا العصبية BSC من خلال لونها البرتقالي الداكن. ينتج عزل الخلايا العصبية PVC و BSC أربعة أطباق ثقافة تحتوي على مجموعات الخلايا العصبية. طبقان يحتويان على مجموعات BSC وطبقين يحتويان على مجموعات PVC.

تخلص من باقي العقد واترك جانبا طبق التشريح 100 ملم لفصل مجموعات الخلايا. ضع طبق ثقافة يحتوي على خلايا على مسرح المجهر منخفض الطاقة وقم بإزالة الغطاء. قم بتحريك الجزء السفلي من طبق الاستزراع المجاور لمجموعة الخلايا برفق.

مع وجود دبوس تشريح دقيق مثبت في ملقط ، قد تكون هناك حاجة إلى خمسة إلى 10 نقرات لفصل الخلايا تماما. ثم كرر مع أطباق الثقافة الأخرى. بعد ذلك ، ضع أطباق الاستزراع التي تحتوي على جزر وسائط مع الخلايا المنفصلة في وعاء كبير يسمح بتدوير الهواء ، مثل طبق بتري بلاستيكي دائري مقاس 150 × 25 ملم.

وضع هذا الطبق في حاضنة مضبوطة على 17 درجة مئوية. بعد ذلك ، ضع طبقا مفتوحا من الماء كمصدر للرطوبة في الغرفة واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح للخلايا بالالتصاق بطلاء البولي ليسين في وسط الطبق. في اليوم التالي ، قم بإغراق الأطباق برفق ب 2.5 مل من مياه البحر الاصطناعية وستربتومايسين البنسلين ، وافحص الخلايا وعدها باستخدام مجهر زراعة الخلايا المقلوب.

فيما يلي الخلايا العصبية الحية BSC بعد يوم واحد في الثقافة ، تكون خلايا BSC بشكل عام أكبر من خلايا PVC عند 40 ميكرون. يظهر هنا خلية عصبية PVC حية بعد أسبوع واحد في الثقافة تظهر نمو العملية. فيما يلي تيار مثير تحمله أيونات الصوديوم استجابة لنبض من الغلوتامات AL ، وهنا تيار استجابة ل D aspartate.

تكون التيارات التي يتم تنشيطها بواسطة NMDA أصغر في السعة بشكل عام من تلك التي يتم تنشيطها بواسطة ناهضات أخرى. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم إتلاف الخلايا العصبية أثناء التفكك. تتمثل إحدى ميزات هذه التقنية في أنها تخلق ثقافتين من كل عقدة ، بحيث يمكن استخدام إحداهما كعنصر تحكم في المطابقة للثقافة التجريبية.

يمكن استخدام هذه التقنية لإنشاء ثقافات أولية للخلايا العصبية من البليجي أو اللافقاريات البحرية الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا العصبية الحسية للplegia عن طريق الهضم الأنزيمي للعقد ، متبوعا بالتفكك الدقيق للخلايا ذات الأهمية.