تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين عدد وجودة حيود بلورات البروتين التي تم الحصول عليها من تجربة فحص التبلور. للقيام بذلك ، يتم تحديد مادة بلورية أو مترسبة من تجربة فحص بلورة البروتين الحالية التي تم إنشاؤها باستخدام بروتين مستهدف محل اهتمام ، ويتم حصاد المادة البلورية أو المترسبة ثم استخدامها لتوليد مخزون من البذور البلورية. بعد ذلك ، يتم إنشاء سلسلة من شاشات التبلور التي تحتوي على كل من البروتين المستهدف المعني والبذور البلورية.

أخيرا ، تتم مراقبة شاشات التبلور المصنفة بحثا عن تكوين البلورات ويتم تمييز أي بلورات بروتينية جديدة. في النهاية ، يمكن أن يؤدي تطبيق هذا الإجراء إلى زيادة حجم العدد وجودة حيود بلورات البروتين التي تم الحصول عليها من تجارب فحص التبلور. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، على سبيل المثال ، البذر الجزئي التقليدي أو البذر الكلي ، في أنه يمكن إجراؤها بسرعة ، وهي قابلة للتطوير بدرجة كبيرة وأخذ عينات من مساحة بلورة أكبر بكثير من طرق البذر الأخرى.

ميزة أخرى لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب استخدام مواد أولية بلورية عالية الجودة لإنتاج مخزون البذور. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن درجة كبيرة من البراعة اليدوية مطلوبة أثناء خطوات حصاد البلورات والتلاعب بها. العرض المرئي لما إذا كانت الطريقة حرجة حيث ينحرف البذر الدقيق للمصفوفة العشوائية بشكل كبير عن طرق البذر البلوري الأخرى.

تعد التفاصيل الدقيقة لهذه الطريقة مفتاح النجاح ، وهناك عدد من هذه الأشياء التي يصعب التواصل بدقة في شكل نص. ابدأ هذا الإجراء فقط بصينية بلورة جالسة باستخدام مجهر مجهر أو نظام تصوير بلوري. افحص الدرج كل يوم للأسبوع الأول.

ثم مرة واحدة في الأسبوع بعد ذلك ، قم بتدوين حجم البلورة. بمجرد عدم وجود دليل على مزيد من النمو ، حدد بئرا مناسبا واحدا أو أكثر من الدرج الذي يتم من خلاله حصاد المواد البلورية. لتوليد مخزون البذور ، يمكن استخدام أي مادة ، بما في ذلك الإبر الدقيقة ، والأضواء اللولبية ، والبلورات الدقيقة ، والبلورات غير المنتظمة سيئة التكوين.

المرجح أن تكون المواد القديمة متشابكة جزئيا وأقل ملاءمة للاستخدام في تجارب البذر. في يوم الحصاد ، استخدم كعكا ملتهبا لعمل مسبار دائري من ماصة المراعي الزجاجية. للقيام بذلك ، قم بتسخين الماصة بالقرب من المنتصف حتى تصبح طرية.

ثم قم بإزالته بسرعة من اللهب واسحبه عن طريق فصل الأطراف عن بعضها. اهدف إلى سحب الزجاج لأسفل إلى قطر أقل من 0.25 ملم عند النقطة التي يبلغ فيها حوالي 0.25 ملم. كسر الزجاج واغمر الطرف المكسور لفترة وجيزة في اللهب.

كرر هذه العملية حتى يتشكل نصف كرة من الزجاج في النهاية بقطر حوالي 0.75 ملم. ضع أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على حبة بذرة على الجليد. بعد ذلك ، افتح درج البلورة المحدد.

حسنا ، ل 24 صواني إسقاط معلقة جيدا. استخدم زوجا من الملقط لإزالة زلة الغطاء. ثم اقلب زلة الغطاء وضعها على سطح نظيف ثابت.

ل 96 صواني إسقاط جيدة. استخدم مشرطا لقطع فيلم السقف البلاستيكي أعلى البئر المحدد ثم قم بإزالة الجزء المقطوع من فيلم السقف باستخدام زوج من الملقط. قم بإزالة 50 ميكرولترا من محلول الخزان وانقل هذا السائل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على حبة البذور ، مما يضمن بقاء الأنبوب على الجليد طوال الوقت أصعب جانب في هذا الإجراء هو تحضير مخزون البذور.

من المهم إجراء ذلك بدقة كما هو موضح وفي أسرع وقت ممكن. احرص على سحق مادة البذور جيدا باستخدام المسبار واستعادتها قدر الإمكان أثناء عرض العينة تحت المجهر. استخدم المسبار الزجاجي المعد مسبقا لسحق البلورات الموجودة على الغطاء تماما.

قطرات الانزلاق. قد تستغرق البلورات الصغيرة عدة دقائق لسحقها جيدا. البلورات التي يسهل سحقها ليست متشابكة وليست بلورات ملح.

بينما تنتج بلورات الملح نقرة مميزة يمكن سماعها والشعور بها عند سحقها. بعد ذلك ، قم بإزالة خمسة ميكرولترات من محلول الخزان من أنبوب حبة البذور ونقله إلى البئر الفرعي المكافئ لتجربة قطرة الجلوس أو زلة الغطاء لتجربة قطرة معلقة تحتوي على المادة البلورية المراد حصادها. ماصة هذا السائل لأعلى ولأسفل من خمس إلى ست مرات لإعادة تعليق أكبر قدر ممكن من البئر الفرعي أو تغطية محتويات الانزلاق.

أعد المعلق إلى أنبوب حبة البذور وكرر هذه الخطوة مرتين أخريين ، مع التأكد من حصاد أكبر قدر ممكن من المواد البلورية. دوامة ، حبة البذور لمدة دقيقتين ، تتوقف كل 30 ثانية لتبريد الأنبوب على الجليد. في 1.5 ، أنابيب مليلتر تحتوي على محلول الخزان.

قم بعمل سلسلة تخفيف لأرشفة تخفيف مخزون البذور في محلول الخزان بمعامل من أربعة إلى 10 في كل مرحلة. إذا لم يتم استخدام البذور والمرق والتخفيفات على الفور ، فضع 10 إلى 20 ميكرولتر في فريزر سالب 20 درجة مئوية أو سالب 80 درجة مئوية للتخزين. بمجرد تجميدها ، يمكن الاحتفاظ بمخزون البذور إلى أجل غير مسمى حتى الحاجة.

يمكن إجراء فحص بلورة RMMS إما باستخدام 24 صينية بئر باستخدام طريقة نشر بخار القطرة المعلقة أو 96 صواني بئر باستخدام طريقة نشر بخار قطرة الجلوس. لإجراء فحص MMS الخاص بنا في 24 صواني إسقاط معلقة جيدا ، استخدم ماصة لنقل 300 ميكرولتر يدويا من كل حالة من شاشة بلورة 96 حالة في 10 ملليلتر. شكل أنبوب واحد لكل بئر من 4 24.

تقوم صواني البلورة المدهونة مسبقا من كل خزان سعة 300 ميكرولتر بنقل ميكرولتر واحد من كل حالة تبلور إلى سطح زلة غطاء بلاستيكية مقابلة تمت إزالة شرائط الدعم الواقية الأمامية والخلفية منها إلى ميكرولتر واحد. على قسيمة الغطاء ، أضف ميكرولتر واحد من محلول البروتين ، ثم 0.5 ميكرولتر من مخزون بذور الكريستال. في الجولة الأولى من RMMS ، من المهم عدم استخدام محلول مخزون البذور المخفف.

نظرا لأنه كلما زاد تركيز البذور ، سيتم الحصول على المزيد من ضربات التبلور. اقلب كل زلة غطاء بحيث يكون قطرة السائل متجها لأسفل ووضعها فوق المناسب. اضغط جيدا لأسفل على زلة الغطاء ، وضغط شحم السقف ، وتشكيل ختم آمن.

بمجرد إنشاء جميع القطرات البالغ عددها 96 قطرة ، انقل الدرج إما إلى حاضنة عند أربع إلى 18 درجة مئوية أو غرفة درجة حرارة ثابتة للتخزين. لإجراء فحص MMS الخاص بنا في 96 صواني إسقاط جيدة. استخدم روبوت تبلور أو ماصة ثماني القنوات لنقل 20 إلى 50 ميكرولترا من كل حالة من شاشة بلورة 96 حالة بتنسيق كتلة بئر عميقة إلى كل بئر مقابل لصينية التبلور.

بعد ذلك ، قم بنقل 1.0 ميكرولتر من محلول البروتين ، و 1.0 ميكرولتر من حالة التبلور و 0.5 ميكرولتر من مخزون البذور إلى القطرات. إغلاق الدرج باستخدام لوح سقف شفاف ونقله إلى حاضنة عند أربع إلى 18 درجة مئوية أو غرفة درجة حرارة ثابتة لإجراء تجارب التخزين يجب فحصها مرة كل 24 ساعة لمدة خمسة أيام بعد التأسيس ، ثم بعد ذلك مرة كل سبعة أيام لمدة تصل إلى أربعة أسابيع باستخدام مجهر مجهر أو نظام تصوير بلوري. افحص كل بئر فرعي أو زلة غطاء بالتسلسل وسجل أي دليل على تكوين البلورات.

قارن نتائج تجارب فحص MMS الخاصة بنا مع تلك من الشاشات غير ED وسجل أي اختلافات. قد تكون هناك حاجة إلى دورات متعددة ملحوظة من RMMS. قبل إنتاج بلورات جودة الحيود المثلى لدورات إضافية.

استخدم مخزون البذور المخفف المؤرشف حسب الحاجة للتحكم في عدد البلورات لكل بئر. لإثبات فعالية RMMS. تم تطبيق طرق الغربلة على تبلور الحناء والليزوزيم الأبيض ومحفز الكبد البقري لكل حالة بروتين 3 96.

تم استخدام شاشات التبلور J-C-S-G-P-A-C-T و Morpheus. ثم بعد خمسة أيام ، تم اختيار شرط واحد من كل صينية تم العثور عليه لدعم نمو المواد البلورية واستخدامه لتوليد مخزون البذور. بعد خمسة أيام ، تم فحص صواني التبلور وتسجيل عدد القطرات بالبلورات.

يلخص هذا الشكل نتائج هذه التجربة ويوفر تحليلا كميا لليزوزيم بياض الدجاجة. لوحظت زيادة من أربعة إلى عشرة أضعاف في معدل نجاح التبلور مقارنة بالصواني غير ED عند تطبيق RMMS على هذا البروتين. وبالنسبة لكبد البقر ، تم العثور على حالة واحدة فقط في شاشة Morpheus لإنتاج بلورات مقارنة ب 55 حالة تم تحديدها بعد استخدام RMMS.

علاوة على ذلك ، كانت هناك زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف ومزدوجة في معدل نجاح تبلور علب الكبد البقري باستخدام شاشات JCSG و PACT على التوالي في جميع الحالات ، وبغض النظر عن شاشة التبلور المستخدمة ، أسفر فحص MMS الخاص بنا عن عدد إجمالي أكبر بكثير من البلورات مقارنة بالفحص غير RMMS. نستنتج أن MMS الخاص بنا هو نهج بسيط ولكنه قوي ، والذي يمكن أن يزيد بشكل كبير من معدل نجاح تجارب فحص تبلور البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة فحص مصفوفة بذرة دقيقة عشوائية من تحديد وحصاد المواد البلورية من خلال تحضير مخزون البذور البلورية ، وأخيرا إنشاء التبلور المصنف بمجرد إتقانه.

يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من ساعة واحدة. بالنسبة لتجارب فحص البذر الدقيقة المصفوفة العشوائية التي يتم إجراؤها باستخدام روبوت مناولة السوائل أو في حوالي ثلاث ساعات للتجارب التي يتم إجراؤها يدويا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من أن جميع شاشات التبلور المصنفة محكمة الغلق جيدا قبل التخزين.