التخميل السطح للدراسات البروتين جزيء واحدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج سطح شريحة كوارتز بجودة عالية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تنظيف شرائح الكوارتز المحفورة أولا وتغطية الزلات بالماء والأسيتون. ثم يتم حفر الشريحة بهيدروكسيد البوتاسيوم ومحلول سمكة الضاري المفترسة لتحسين جودة السطح.

بعد ذلك ، يتم تشغيل الشرائح وزلات الغطاء باستخدام مجموعات الأمين متبوعة بجولتين من السطح باستخدام بوليمر لجعل سطح الزجاج خاملا. تتمثل الخطوة الأخيرة في تجميع غرفة الموائع الدقيقة من الشريحة وانزلاق الغطاء مع مواجهة الأسطح المطلية بالبولي إيثيلين جلايكول أو الأسطح المبطنة ببعضها البعض. في النهاية ، تعمل استراتيجية جديدة لمعالجة السطح بجزيئات الوتد على مدى جولتين على تحسين جودة التخميل بشكل ملحوظ كما لوحظ في الفحص المجهري الفلوري أحادي الجزيء.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو التقنيات الحالية مثل طلاء البوليمر بعد نقش أكسيد البوتاسيوم هي أن هذه التقنية تضمن جودة عالية. سيكافح الأشخاص الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب إجراء علاجات خدمة متعددة. لبدء الحفر ، ينزلق الكوارتز كما هو مفصل في بروتوكول النص.

نظف الشرائح عن طريق وضع الشرائح في وعاء تلطيخ زجاجي. عادة ما يمكن وضع خمس إلى 15 شريحة في جرة واحدة. ثم اشطف الشرائح بماء UE بعد تكرار الشطف ثلاث مرات ، وقم بصوتنة الشرائح بماء UE لمدة خمس دقائق لإزالة الأوساخ ، والتخلص من الماء وشطف الشرائح ثلاث مرات إضافية بماء UE.

بعد ذلك ، استبدل ماء UE بالأسيتون وقم بصوتنة الشرائح بالأسيتون لمدة 20 دقيقة أو أكثر ، وتخلص من الأسيتون واشطف الشرائح بماء Milli Q لإزالة أي بقايا الأسيتون. بعد ذلك ، استبدل الماء بهيدروكسيد البوتاسيوم المولي وقم بصوتنة الشرائح لمدة 20 دقيقة أو أكثر. سيؤدي النقش المفرط إلى تحسين جودة السطح ، ولكنه سيؤدي إلى حدوث خدوش قد تتداخل مع التصوير الفلوري.

اشطف الشرائح بماء Milli Q ثلاث مرات لإزالة آثار هيدروكسيد البوتاسيوم لإجراء حفر سمكة الضاري المفترسة. انقل الشرائح إلى حامل منزلق دوران أو حامل تفلون مصنوع خصيصا ، وضعه في دورق سعة لتر واحد موجود في غطاء كيميائي. املأ الدورق ب 450 مل من حامض الكبريتيك.

ثم أضف 150 مل من بيروكسيد الهيدروجين لنسبة ثلاثة إلى واحد بين حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين. قلب المحلول للخلط الصحيح واترك الدورق دون إزعاج لمدة 20 دقيقة. أخرجي الشرائح من محلول سمكة البيرانا وضعيها في حامل منزلق يحتوي على ماء ميليو.

في هذه الأثناء ، تخلص من محلول سمكة البيرانا في زجاجة نفايات مخصصة بمجرد وصوله إلى درجة حرارة الغرفة ، اشطف الشرائح ثلاث مرات بماء UE بعد تنظيف زلة الغطاء. استبدل ماء UE في أطباق التلوين بالميثانول. احتفظ بالشرائح والغطاء ينزلق في الميثانول.

في هذه الأثناء ، قم بإعداد محلول الجزر الأمينية عن طريق صب 100 مل من الميثانول في القارورة. ثم أضف خمسة ملليلتر من حمض الأسيتيك وثلاثة ملليلتر من ثلاثة أمينو بروبيل ، ثلاثي ميثيل ، واخلطهم برفق عن طريق الرج. استبدل الميثانول في أطباق التلوين التي تحتوي على الشرائح والغطاء ينزلق بخليط تفاعل الصوامع الأمينية.

احتضان لمدة 20 إلى 30 دقيقة أثناء الحضانة صوتنة مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، استبدل تفاعل الجزيرة الأمينية بالميثانول. ثم تخلص من الميثانول وأضف محلول الميثانول الطازج.

كرر هذا الإجراء ثلاث مرات للجولة الأولى من السطح باستخدام البوليمر أولا ، جفف الشرائح وانزلق الغطاء باستخدام غاز النيتروجين. ثم ضعها في صناديق ماصة نظيفة مملوءة جزئيا بماء مللي كيو بحيث يكون الجانب الذي يجب أن يكون متجها لأعلى. بعد ذلك ، أضف 64 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتفاعل المحضر حديثا إلى محلول الوتد المجهز.

ماصة الخليط لأعلى ولأسفل حتى يذوب تماما. ثم جهاز الطرد المركزي عند 16 ، 100 جم لمدة دقيقة واحدة. لإزالة فقاعات الهواء ، قم بإسقاط 70 ميكرولترا من خليط pegylation على شريحة كوارتز مجففة.

ضع غطاء مجفف برفق فوق المحلول ، واحتضن الشرائح في بيئة مظلمة ورطبة لمدة ساعتين إلى ليلة وضحاها لتخزين الشرائح المبطنة وزلات الغطاء. قم بتفكيك الشريحة وانزلاق الغطاء بعناية عن طريق تحريك زلة الغطاء إلى جانبه وشطفها بماء UE قبل تجفيفها بغاز النيتروجين. ضع زوجا من الشريحة وغطاء زلة في أنبوب سعة 50 مليلتر بحيث تكون الأسطح المبطنة متجهة بعيدا عن بعضها البعض.

أغلق الأنبوب جزئيا ونظفه بالمكنسة الكهربائية قبل ملئه بغاز النيتروجين وشد الغطاء بإحكام. قم بتخزينه على درجة حرارة سالب 20 درجة مئوية. تساعد هذه الخطوات في الحفاظ على السطح المغطى لفترة طويلة من الزمن.

قم بإجراء جولة ثانية من التنقيب كما هو موضح في بروتوكول النص مباشرة قبل استخدام الشريحة لتجميع غرفة الموائع الدقيقة. ضع شريحة كوارتز على سطح مستو بحيث يكون الجانب المغطى متجها لأعلى. اصنع قناة قطريا على السطح المغطى بوضع شريط لاصق على الوجهين فوق الشريحة.

تأكد من وضع الثقوب في وسط القناة. ثم ضع برفق زلة غطاء pegylated في الأعلى لإكمال الغرفة. مع توجيه الجانب المغطى لأسفل.

أغلق الغرفة بالضغط على زلة الغطاء فوق المناطق التي يتم فيها وضع الشريط على الوجهين. افعل ذلك برفق ولكن بدقة حتى تصبح الغرفة محكمة الغلق بالماء. أخيرا ، أغلق حواف الغرفة بغراء الايبوكسي.

تابع شل حركة الستربتافيدين أو الترافان المحايد وأضف جزيئات بيولوجية بيوتينيل لتصوير جزيء واحد كما هو موضح في بروتوكول النص ، إذا تم إجراء السطح بنجاح ، فهناك أقل من 10 بروتينات غير ممتصة على وجه التحديد لكل منطقة تصوير لوحظت. عند إضافة واحد إلى 10 بروتين نانومولار مسمى بالفلورسنت إلى الغرفة ، عندما لا يتم تنفيذ أي من خطوات التنظيف أو التفاعل بشكل صحيح ، يزداد عدد البروتينات غير الممتصة بشكل كبير. على سبيل المثال ، إذا تم تخطي نقش سمكة البيرانا ، فهناك 100 مرة أكثر من الامتصاص غير المحدد.

الطبيعة الفائقة للتجميل المزدوج بشكل بارز هنا. لوحظ أن إشارات الخلفية من جزيئات الفلورسنت والمحلول كانت أضعف بكثير عند استخدام التبيج المزدوج كما هو موضح في اللوحة اليسرى. يشير هذا إلى أن البروتينات يتم صدها بشكل أكثر فعالية بواسطة الطبقة المصابة بشكل مزدوج.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. لا تنس أن العمل مع AYA يمكن أن يكون احتياطات خطيرة للغاية مثل القفازات المناسبة والنظارات الواقية والمئزر التي يجب دائما اتخاذها أثناء تنفيذ هذا الإجراء.