التخميل السطح للدراسات البروتين جزيء واحدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على سطح شريحة كوارتز معالج بجودة فائقة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تنظيف شرائح الكوارتز المثقوبة وأغطية الشرائح أولاً بالماء والأسيتون، ثم يتم نقش الشريحة باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم ومحلول بيرانا لتعزيز جودة السطح.

بعد ذلك، يتم وظيفياً تعديل الشرائح وأغطيتها بمجموعات الأمين، تليها جولتان من معالجة السطح باستخدام بوليمر لجعل السطح الزجاجي خاملاً. وتتمثل الخطوة النهائية في تجميع غرفة الموائع الدقيقة من الشريحة وغطائها بحيث تكون الأسطح المغلفة بالبولي إيثيلين جلايكول أو المـ "بجيلة" (pegylated) مواجهة لبعضها البعض. وفي النهاية، أدت استراتيجية جديدة لمعالجة السطح بجزيئات الـ peg على مدار جولتين إلى تحسين جودة التخميد بشكل ملحوظ، كما لوحظ بواسطة مجهر الفلورسنت للجزيء الواحد.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية، مقارنة بالتقنيات الحالية مثل الطلاء البوليمري بعد النقش بأكسيد البوتاسيوم، في أنها تضمن جودة فائقة. قد يواجه الأشخاص الجدد في استخدام هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً لضرورة إجراء معالجات خدمية متعددة. وللبدء في عملية الثقب، يتم تحضير شرائح الكوارتز كما هو مفصل في البروتوكول النصي.

نظف الشرائح بوضعها في وعاء تلوين زجاجي. عادةً ما يمكن وضع من خمس إلى 15 شريحة في وعاء واحد. بعد ذلك، اشطف الشرائح بماء UE بعد تكرار عملية الشطف ثلاث مرات، ثم عرّض الشرائح للموجات فوق الصوتية (sonicate) باستخدام ماء UE لمدة خمس دقائق لإزالة الشوائب، وتخلص من الماء ثم اشطف الشرائح ثلاث مرات إضافية بماء UE.

بعد ذلك، استبدل مياه UE بالأسيتون وقم بمعالجة الشرائح بجهاز سونيكيشن باستخدام الأسيتون لمدة 20 دقيقة أو أكثر، ثم تخلص من الأسيتون واشطف الشرائح بمياه Milli Q لإزالة أي بقايا من الأسيتون. بعد ذلك، استبدل الماء بمحلول هيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز one molar وقم بمعالجة الشرائح بجهاز سونيكيشن لمدة 20 دقيقة أو أكثر. إن النقش المفرط سيعزز من جودة السطح، ولكنه سيؤدي إلى ظهور خدوش قد تتداخل مع التصوير الفلوري.

اشطف الشرائح بماء Milli Q ثلاث مرات لإزالة آثار هيدروكسيد البوتاسيوم تمهيداً لإجراء عملية النقش بمحلول البيرانا. انقل الشرائح إلى حامل شرائح Duran أو حامل تيفلون مُصنع خصيصاً، وضعها في دورق سعة لتر واحد موجود داخل خزانة سحب الغازات الكيميائية. املأ الدورق بـ 450 milliliters من حمض الكبريتيك.

ثم أضف 150 milliliters من hydrogen peroxide لتحقيق نسبة 3:1 بين sulfuric acid و hydrogen peroxide. قلّب المحلول لضمان الخلط الجيد واترك الكأس دون تحريك لمدة 20 minutes. أخرج الشرائح من محلول piranha وضعها في حامل شرائح يحتوي على millieu water.

في هذه الأثناء، تخلص من محلول البيرانا في زجاجة نفايات مخصصة. وبمجرد أن يصل المحلول إلى درجة حرارة الغرفة، اشطف الشرائح ثلاث مرات بماء UE متبعاً خطوات تنظيف غطاء الشريحة. استبدل ماء UE في أطباق التلوين بالميثانول. احتفظ بالشرائح وأغطية الشرائح في الميثانول.

في هذه الأثناء، قم بتحضير محلول السيلنة الأمينية عن طريق صب 100 milliliters من الميثانول في الدورق. ثم أضف five milliliters من حمض الخليك و three milliliters من ثلاثي أمينو بروبيل، تريميثيل، واخلط المزيج برفق عن طريق الرج. استبدل الميثانول في أطباق التلوين التي تحتوي على الشرائح وأغطية الشرائح بخليط تفاعل السيلنة الأمينية.

قم بالتحضين لمدة 20 إلى 30 دقيقة، مع إجراء عملية سونكة لمرة واحدة لمدة دقيقة واحدة أثناء التحضين. بعد ذلك، استبدل تفاعل عزل الأمين بالميثانول. ثم تخلص من الميثانول وأضف محلول ميثانول جديداً.

كرر هذا الإجراء ثلاث مرات للجولة الأولى من معالجة السطح. باستخدام البوليمر أولاً، جفف الشرائح وأغطية الشرائح باستخدام غاز النيتروجين. ثم ضعها في صناديق ماصات نظيفة مملوءة جزئيًا بماء milli Q بحيث يكون الجانب الذي سيخضع لعملية الـ pegylation متجهًا للأعلى. بعد ذلك، أضف 64 µL من محلول التفاعل المحضر حديثًا إلى محلول peg جاهز.

قم بسحب الخليط وطرحه باستخدام الماصة لضمان الإذابة الكاملة. ثم قم بالطرد المركزي عند 16,100 G لمدة دقيقة واحدة. ولإزالة الفقاعات الهوائية، ضع 70 µL من خليط البجيلة (pegylation mixture) على شريحة كوارتز مجففة.

ضع غطاء شريحة مجففاً برفق فوق المحلول، ثم حضن الشرائح في بيئة مظلمة ورطبة لمدة تتراوح من ساعتين إلى ليلة كاملة لتخزين الشرائح وأغطيتها المبيجيلة (pegylated). قم بفك الشريحة وغطاء الشريحة بعناية عن طريق إزاحة الغطاء إلى الجانب وشطفهما بماء UE قبل تجفيفهما بغاز النيتروجين. ضع زوجاً من الشريحة وغطائها في أنبوب سعة 50 milliliter بحيث تكون الأسطح المبيجيلة متجهة بعيداً عن بعضها البعض.

أغلق الأنبوب جزئياً وقم بتفريغه من الهواء قبل ملئه بغاز النيتروجين وإحكام ربط الغطاء. يُحفظ عند درجة حرارة -20 °C. تساعد هذه الخطوات في الحفاظ على السطح المبيجلي (pegylated) لفترة زمنية طويلة.

قم بإجراء جولة ثانية من عملية الـ pegylation كما هو موضح في البروتوكول النصي مباشرة قبل استخدام الشريحة لتجميع غرفة مائعية دقيقة. ضع شريحة كوارتز على سطح مستوٍ بحيث يكون الجانب المعالج بالـ pegylated متجهًا للأعلى. اصنع قناة بشكل قطري على السطح المعالج بالـ pegylated عن طريق وضع شريط لاصق مزدوج الوجه فوق الشريحة.

تأكد من وضع الثقوب في مركز القناة. ثم ضع برفق شريحة تغطية مُبَـجـلـة (pegylated) في الأعلى لإكمال الغرفة، بحيث يكون الجانب المُبَـجـلـة متجهاً للأسفل.

قم بإغلاق الغرفة عن طريق الضغط بغطاء الشريحة فوق المناطق التي وُضع فيها الشريط ذو الوجهين. افعل ذلك برفق ولكن بدقة لضمان إغلاق الغرفة بإحكام ضد تسرب المياه. وأخيراً، أغلق حواف الغرفة باستخدام غراء الإيبوكسي.

باشر بتثبيت الستريبتاديفين (streptavidin) أو النيوترادفين (neutravidin) وأضف الجزيئات البيولوجية المبيوتنة (biotinylated) للتصوير أحادي الجزيء كما هو موضح في البروتوكول النصي؛ فإذا تمت عملية معالجة السطح بنجاح، سيكون عدد البروتينات الممتصة بشكل غير نوعي أقل من 10 بروتينات لكل منطقة تصوير يتم رصدها. وعند إضافة بروتين مُوسوم فلورياً بتركيز يتراوح من 1 إلى 10 نانومولار (nanomolar) إلى الحجرة، يزداد عدد البروتينات الممتصة بشكل غير نوعي زيادة ملحوظة في حال عدم تنفيذ أي من خطوات التنظيف أو التفاعل بشكل صحيح. على سبيل المثال، إذا تم تخطي مرحلة النقش بمحلول البيرانا (piranha etching)، يزداد الامتصاص غير النوعي الملحوظ بمقدار 100 ضعف.

تظهر هنا بوضوح الطبيعة المتفوقة لعملية الـ double pegylation. وقد لوحظ أن إشارات الخلفية الناتجة عن الجزيئات الفلورية والمحلول كانت أضعف بكثير عند استخدام الـ double pegylation كما هو موضح في اللوحة اليسرى. ويشير هذا إلى أن البروتينات يتم تنافرها بشكل أكثر فعالية بواسطة طبقة الـ doubly pegylated.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون أربع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. لا تنسَ أن العمل مع AYA قد يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات والنظارات الواقية والمئزر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.