توطين والكمي النسبية من أنابيب الكربون النانوية في الخلايا مع متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

الهدف العام من التجربة التالية هو توفير طريقة مترولوجية نانوية لمراقبة وقياس الامتصاص الخلوي للأنابيب النانوية الكربونية في عدد ذي صلة إحصائيا من الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الخلايا أولا بأنابيب نانوية كربونية قابلة للتشتت بالماء ، والتي تدخل الخلايا بطريقة تعتمد على التركيز. يتم تمييز هذه الأنابيب النانوية الكربونية في النهاية بعلامة الفلورسنت.

ثم بعد التثبيت ، يتم تصوير كل خلية في المجال الساطع والمجال المظلم والقنوات الفلورية لتدفق التصوير متعدد الأطياف. مقياس الخلوي. لتصور توزيع الأنابيب النانوية الكربونية ومستوى امتصاص الضوء والضوء المتناثر والفلورة ، تحفز ملصقات الأنابيب النانوية في كل خلية على أساس بكسل تلو الآخر. في النهاية ، يسمح امتصاص الضوء الجوهري والتشتت داخل الخلايا بتوطين الأنابيب النانوية الكربونية وتقديرها.

لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جديدة في مجالات علم السموم النانوية والطب النانوي ، مثل تأثير ومصير المواد القائمة على الكربون في الخلايا الحية ، وكذلك إمكانات وعاء الأنابيب النانوية الكربونية كنظام توصيل للأدوية ابدأ بتشتيت الأنابيب النانوية الكربونية المقترنة في النهاية بعلامة الفلورسنت في مياه زراعة الخلايا. ثم صوتنة الأنابيب النانوية في سونيكات مياه الحمام عند 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الأنابيب النانوية بتركيزات 0 و 10 و 20 و 50 ميكروغرام لكل مليلتر في وسط كامل ، ثم احتضان ملليلترين من كل تخفيف بالخلايا ذات الأهمية في 1 25 سنتيمترا مربعا لكل لوح عند 37 درجة مئوية بعد 20 ساعة ، وقم بإزالة وسط الحضانة من كل لوحة واشطف الخلايا المسماة بأنبوب نانو الكربوني باستخدام PBS.

بعد الغسيل ، يراقب التربسين الخلايا الموجودة على كل طبق ثم يعيد تعليقها في وسط DMEM كامل. بعد ذلك ، انقل كل عينة إلى أنابيب صقر فردية سعة 15 مليلتر ، ثم قم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 200 ضعف G ودرجة حرارة الغرفة. أعد تعليق كل حبيبات في 4٪ بارا فورمالديهايد عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد التثبيت ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وأعد تعليق كل عينة حبيبية عند 15 في 10 إلى الخلايا الخامسة في 150 ميكرولتر من PBS. ثم قم بتصفية العينات من خلال مصافي شبكية فردية 50 ميكرون للحصول على صور للخلايا باستخدام دفق الصور. مقياس تدفق التصوير متعدد الأطياف.

أولا ، حدد تكبيرا معدلا ثم عينات الصور ذات الأهمية. استخدم ليزر 685 نانومتر لتصوير المجال المظلم وضبط مقياس التدفق الخلوي. القناة رقم ستة لجمع انبعاث المجال المظلم عند ممر نطاق من 745 إلى 800 نانومتر.

قم بتصوير العينات في الحقل الساطع رقم واحد وعدد ست قنوات الحقل المظلم لتحليل الصور. أولا ، قم بإنشاء مخطط نقطي بارامتري مع نسبة العرض إلى الارتفاع مقابل مساحة الخلية. يسمح ذلك بتمييز الخلايا المفردة التي لها مساحة قياسية ونسبة عرض إلى ارتفاع قريبة من واحد من الأحداث متعددة الخلايا ، والتي لها مساحة كبيرة ونسبة عرض إلى ارتفاع صغيرة ، والحطام الذي يظهر مساحة صغيرة للغاية.

بعد استخدام صور الخلية للتحقق من تحديد الخلايا المفردة بشكل صحيح ، قم بإعداد مخطط نقطي ثنائي البارامتري للخلايا المسماة بأنبوب نانو كربوني شديد التباين عن طريق رسم التباين مقابل التدرج المربع المتوسط للجذر للسماح باستبعاد الجذر المنخفض ، ومتوسط التدرج المربع ، والخلايا غير المركزة ذات التباين المنخفض ، واختيار الخلايا في المستوى المركز. بعد ذلك ، استخدم أداة البحث عن أفضل ميزة لتحديد المعلمة التي توفر أفضل فصل إحصائي بين الخلايا المسماة وغير المسماة. على سبيل المثال ، بالنسبة لهذه التجربة التمثيلية ، فإن ميزة كائن البكسل المتوسط هي الأنسب.

ثم ارسم هذه المعلمة مقابل التردد الطبيعي لتتبع الرسم البياني لقياس الأنابيب النانوية التي تتناولها الخلايا عند كل تركيز تجريبي. الآن ارسم رسما بيانيا ثنائي البارامتري لجسم البكسل المتوسط في المجال الساطع مقابل الشدة في المجال المظلم. للتحقق من الارتباط بين هاتين المعلمتين ، يتم أيضا تقييم القياس الكمي لأنبوب النانو عن طريق إنشاء صور على الخلية حيث تظهر الأنابيب النانوية الكربونية كبقع داكنة مكثفة في قناة Brightfield ، حدد نطاقا مقيدا من وحدات البكسل ذات الكثافة المنخفضة ، على سبيل المثال ، بين صفر و 533 لإنشاء قناع العتبة ، واحد يناسب الأنابيب النانوية الداكنة على وجه التحديد لإنشاء قناع ثان يشار إليه القناع الثاني لتصور الأنابيب النانوية التي تبدو ساطعة في قناة المجال المظلم.

حدد نطاقا من وحدات البكسل ذات الكثافة العالية. على سبيل المثال ، تم اختيار نطاق 150 إلى 4 ، 095 لهذه التجربة. ثم باستخدام المنطقة من قناع المجال الساطع الأول أو قناع المجال المظلم الثاني ، قم بإعداد مخطط نقطي لتحديد الاستيعاب النسبي للأنابيب النانوية.

على سبيل المثال ، ارسم المنطقة على القناة السادسة المقابلة للحقل المظلم باستخدام القناع الثاني مقابل المنطقة الموجودة في القناة الأولى ، المقابلة للحقل الساطع مع القناع الأول. بعد تحديد الارتباط الخطي بين القناع الأول والقناع الثاني ، تصور الأنابيب النانوية داخل السيتوبلازم عن طريق إنشاء قناع للخلية بأكملها أولا ثم تآكل القناع. يشار إليه الآن بتآكل M 0 1 7 × سبعة بكسل لعرض الجزء الداخلي من الخلية.

لتصور الأنابيب النانوية الكربونية داخل غشاء الخلية ، استخدم المعادلة المنطقية M صفر واحد ولا تتآكل M 0 1 7. هذا هو قناع الخلية بأكملها ، يتم طرحه من داخل الخلية لإنشاء قناع للغشاء فقط لتقييم وحدات البكسل الداكنة على الغشاء. ضع قناع المجال الساطع على قناع الغشاء.

قم بتطبيق كل هذه الأقنعة على خلايا متعددة في وقت واحد لتأكيد التمييز بين العينات المسماة وغير المسماة. ثم حدد وحدات البكسل السوداء على الغشاء باستخدام أداة منطقة الميزة لتحديد الأنابيب النانوية الكربونية على غشاء الخلية. أخيرا ، للتمييز بين الأنابيب النانوية الكربونية التي تم استيعابها من تلك التي تم امتصاصها على الغشاء.

مؤامرة ، المنطقة السوداء للغشاء ضد المنطقة السوداء للخلية بأكملها. بمجرد إنشاء جميع المخططات لشرط تجريبي واحد، قم بإنشاء قالب تقرير إحصائي. احفظ القالب كملف A ST وقم بتجميع جميع ملفات البيانات.

ينتج جهاز دفق الصور صورا متعددة عالية الدقة لكل خلية في مقياس التدفق الخلوي ، بما في ذلك قنوات المجال الساطع والمجال المظلم والفلورة ، كما هو موضح هنا مع ثلاث خلايا مختلفة تسمى أنابيب نانو. يتم أيضا عرض تراكبات هذه القنوات. يؤدي وجود الأنابيب النانوية الكربونية إلى حدوث تغييرات في كل من التباين والتدرج في الخلايا المسماة مقارنة بالخلايا غير المصنفة.

وبالتالي ، فإن إنشاء مخطط نقطي ثنائي المعلمات مهم لاختيار خلايا التركيز. يمكن تمييز الخلايا غير المركزة باللون الأصفر من خلال تباينها المنخفض ومتوسط التدرج التربيعي للجذر المنخفض بغض النظر عن وجود أو عدم وجود ملصقات الأنابيب النانوية. تظهر خلايا التركيز غير المسمى أيضا تباينا منخفضا ، ولكنها تظهر جذرا عاليا ، متوسط تدرج مربعي عندما يتم تصنيف خلايا التركيز بأنابيب نانوية ، ومع ذلك ، تظهر الخلايا تباينا عاليا ، وجذر منخفض ، ومتوسط مظهر التدرج المربع.

يمكن تمييز الأنابيب النانوية الكربونية الداخلية بسهولة ، لا سيما في قناة برايتفيلد ، حيث تظهر على شكل بقع داكنة مكثفة ، تزداد مناطقها مع تركيز الأنابيب النانوية. عندما يتم تحليل متوسط إشارات البكسل لصور المجال الساطع ، يمكن تحديد القياس الكمي النسبي لامتصاص أنبوب النانو. على سبيل المثال ، توضح هذه الرسوم البيانية الزيادة الكبيرة في امتصاص الأنابيب النانوية التي تحدث مع كل زيادة في تركيز وضع العلامات على أنبوب النانو كما هو موضح ، فإن القياس الكمي لأنبوب النانو الكربوني ممكن أيضا من خلال استخدام الأقنعة المطبقة إما على نطاق مقيد من وحدات البكسل الداكنة داخل صورة المجال الساطع ، أو ضمن وحدات البكسل عالية الكثافة داخل المجال المظلم ، المقابلة للمناطق التي توجد بها الأنابيب النانوية.

رسم مساحة هذه الأقنعة بمزيد من القياس الكمي لامتصاص أنبوب الكربون النانوي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم الارتباط بين البقع في صور المجال الساطع والداكن عن طريق رسم شدة المجال المظلم مقابل إشارة متوسط البكسل للمجال الساطع ، أو عن طريق رسم مساحة القناع داخل المجال الساطع مقابل المنطقة داخل المجال المظلم. في هذين الشكلين التاليين ، يتم عرض تحليلات للأنابيب النانوية الكربونية الموضعية داخل داخل الخلية.

توضح هذه الصور الأولى الأقنعة المختلفة التي تم إنشاؤها. لاحظ أنه يجب التحقق من متانة أقنعة الترجمة المستندة إلى تآكل قناع الخلية الافتراضي بشكل مرئي على مجموعة الخلايا المسماة وغير المسماة. كما هو موضح للتو في هذه المخططات النقطية ، تم رسم المساحة الإجمالية للبقع السوداء على غشاء الخلية مقابل مساحة الخلية بأكملها لتحديد درجة الاستيعاب.

بالنسبة للخلايا التي تم تحضينها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مقارنة بالخلايا التي تم تحضينها لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية عند أربع درجات مئوية ، توجد الأنابيب النانوية الكربونية في الغالب على الغشاء ، بينما عند 37 درجة مئوية ، يتم استيعاب الأنابيب النانوية الكربونية في أكثر من 90٪ من الخلايا. لا يعد تألق الأنبوب النانوي الكربوني مؤشرا جيدا على استيعاب الأنابيب النانوية الكربونية بسبب الارتباط المنخفض جدا بين بقع الفلورسنت والبقع داخل قنوات المجال الساطعة والمظلمة. في الواقع ، يشير الارتباط بين شدة fitzy ومتوسط البكسل للمجال الساطع إلى معامل ارتباط بيرسون سالب 0.2.

كما هو موضح في هذه الصور ، لا تتطابق إشارة الفلورسنت بشكل موثوق مع البقع السوداء للمجال الساطع ، والأنابيب النانوية الكربونية ، والحبس ، والتجميع داخل الجسيمات الحالة داخل الخلايا التي أطفأت جزئيا إشارة الفلورسنت. في المقابل ، قد تعطي الأنابيب النانوية المشتتة إشارة فلورية أكثر موثوقية بعد تطويرها. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تكنولوجيا النانو والطب النانوي لاستكشاف تفاعل الخلايا الحية مع المواد النانوية القائمة على الكربون أو أي مواد نانوية ذات قدرة عالية على الامتصاص والتشتت الحيوي باستخدام طريقة قياس الخلايا الإحصائية عالية الإنتاجية.