موت الخلايا المرتبطة الانقسام الشاذ التي لاحظها التصوير متحد البؤر في الخلايا السرطانية لايف

الهدف العام من التجربة التالية هو ملاحظة التأثير السام للخلايا لمشتق philanthr المسمى PJ 34 أثناء الانقسام الفتيلي في خلايا سرطان بشرية متعددة المراكز الجسيمية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق وسم الجسيمات المركزية بـ GFP gamma tubulin والكروموسومات بـ H two B read عن طريق عفن التحول (transfection). والهدف من عملية عفن التحول هو تمكين تتبع هجرة وتجمع الجسيمات المركزية وترتيب الكروموسومات أثناء الانقسام الفتيلي في خلايا سرطانية حية متعددة المراكز الجسيمية.

كخطوة ثانية، يتم تعريض بعض الخلايا المنقولة جينياً إلى PJ 34، وهو جزيء يعمل كعامل لتنقية الجسيمات المركزية الزائدة. بعد ذلك، يتم فحص الخلايا السرطانية الحية المنقولة جينياً باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) لرصد الأحداث التي تقع أثناء الانقسام الفتيلي والمرتبطة بهجرة الجسيمات المركزية والكروموسومات. وتظهر الصور المتسلسلة المجمعة أو المعاد ترتيبها آثار التنقية والتأثيرات السامة للخلايا الناتجة عن المعالجة بـ PJ 34 في الخلايا السرطانية أثناء الانقسام الفتيلي، بناءً على التصوير البؤري للخلايا الحية.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج موجه للسرطان يعمل على استئصال الخلايا السرطانية الجسمية حصرياً أثناء الانقسام الفتيلي. سيقوم باستعراض هذه التقنية متعاونانا الدكتور Asher Castillo من مركز أبحاث السرطان في مركز شيبا الطبي، والدكتور Leonid middleman من وحدة التصوير في مدرسة Sacko للطب بجامعة تل أبيب. لتحضير خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 للتصوير المجهري البؤري الحي، يتم استزراع 2×10⁵ من الخلايا في أطباق زراعة ذات قاع زجاجي مطلية بـ Poly-D-Lysine وبقطر 35 mm في 2 mL من الوسط الغذائي الكامل، ثم تُحضن في 5% CO2 عند 37 °C.

تكون المزرعة الخلوية جاهزة لعملية عفن الخلية (transfection) عندما تصل درجة التلاقي (confluence) إلى 60 إلى 70%. سيتم عفن الخلايا باستخدام بلازميدين، أحدهما يشفر gamma tubulin و GFP للكشف الفلوري عن الجسيمات المركزية (centrosomes)، والآخر يشفر histone red للكشف الفلوري عن الكروموسومات؛ وتتم عملية العفن باستخدام كاشف العفن الليبوزومي jet PI وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثم استبدل الوسط الخلوي بـ 2 mL من DMEM الدافئ بدون إضافات. أضف خليط العفن بلطف إلى الخلايا الموجودة في DMEM، ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة ثماني ساعات.

استبدل DMEM بـ 2 mL من الوسط الكامل، ثم قم بتحضين الخلايا في الحاضنة لمدة 24 hours. وبعد عملية عفن الخلايا (transfection)، استبدل الوسط بـ 2 mL من الوسط الكامل الذي يحتوي على 20 micromolar من PGA 34.

تُحضن الخلايا لمدة 18 ساعة إضافية قبل التصوير المجهري البؤري الحي. فيما يلي المعلمات التقنية لإعدادات ماسح التصوير المجهري البؤري الحي. وضع المسح XYZT، الثقب (pinhole) airy 1.00، التكبير 3.5، الدقة ثماني بتات، ليزر DPSS 561 nanometers، ليزر الأرجون المرئي 488 nanometers، وليزر الهيليوم-نيون المرئي 633 nanometers.

العدسة الشيئية H-C-X-P-L-A-P-O-C-S بتكبير 63 مرة، وفتحة عددية 1.4 زيتية UV بقيمة 1.4. سرعة المسح 700 هرتز ومعامل الانكسار 1.52. تُخضع الخلايا للتصوير المجهري البؤري الحي لمدة 16 ساعة على الأقل في غرفة تصوير، مع الحفاظ على الخلايا في وسط يحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون ودرجة حرارة 37 درجة مئوية.

سيتم فحص كفاءة عفن الخلايا (transfection) باستخدام المجهر الفلوري. ابدأ هذا الإجراء بزراعة 2 × 10⁵ من خلايا MDA MB 231 في طبق سداسي الفجوات، بحيث تحتوي كل فجوة على شريحة غطاء واحدة في 2 mL من الوسط الغذائي الكامل. قم بإجراء عفن الخلايا بنفس الطريقة السابقة باستخدام كاشف العفن الليبوزومي jet PI وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

بعد 36 ساعة من عملية التعداء. يتم إزالة الوسط من كل بئر بعد غسل الخلايا المعداة المثبتة على شريحة غطاء باستخدام PBS. تُثبت الخلايا عن طريق الحضن في محلول بارد من الميثانول والأسيتون بنسبة واحد إلى واحد لمدة سبع دقائق عند درجة حرارة -20 °C.

بعد مرور سبع دقائق، اسحب محلول التثبيت واترك غطاء الشريحة الذي يحتوي على الخلايا المثبتة ليجف في خزانة استخلاص كيميائية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، ضع كاشف prolonged gold anti fade مع DPI واترك غطاء الشريحة ليجف في الظلام لمدة ست ساعات. افحص الشريحة تحت مجهر فلوري واحسب النسبة المئوية للخلايا المنقولة التي تظهر إشارات حمراء وخضراء.

من إجمالي عدد الخلايا، تكون نسبة عفن الخلايا المطلوبة حوالي 20 إلى 40% عند عد 100 إلى 200 خلية. لبدء هذا الإجراء، يتم استزراع 2 × 10⁵ من خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 على شرائح غطاء زجاجية في طبق بست تحاديق في 2 mL من الوسط الغذائي الكامل. يُضاف PJ 34 إلى الوسط الغذائي وتُحضن الخلايا للمدة المطلوبة.

عند انتهاء فترة الحضن، اغسل شرائح التغطية مرة واحدة باستخدام PBS وثبّت الخلايا عن طريق الحضن في محلول من الميثانول والأسيتون المبردين إلى درجة التجمد بنسبة واحد إلى واحد لمدة سبع دقائق عند درجة حرارة 20- °C. بعد ذلك، اشفط محلول التثبيت واترك شرائح التغطية لتجف في خزانة استخلاص كيميائية لمدة 30 دقيقة. اغسل شرائح التغطية مرة واحدة باستخدام PBST لنفاذية الأغشية الخلوية، ثم قم بحجب الخلايا باستخدام 10% من مصل الحمير الطبيعي في PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بتحضير خليط الأجسام المضادة الأول عن طريق إضافة الأجسام المضادة الأولية anti-alpha tubulin و anti-gamma tubulin إلى محلول الحجب والخلط باستخدام جهاز vortex. بعد ذلك، ضع 100 µL من خليط الأجسام المضادة لكل شريحة غطاء على غطاء طبق سداسي الفجوات. اقلب شريحة الغطاء وضعها برفق فوق قطرة الأجسام المضادة، ثم اتركها لتحضن لمدة ساعتين.

أضف في درجة حرارة الغرفة. سيؤدي ذلك إلى صبغ المغازل والجسيمات المركزية. أعد أغطية الشرائح إلى الآبار واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBST.

بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الثانوية، LOR 488 و LOR 568 بمعدل قطرة واحدة لكل شريحة غطاء على غطاء طبق سداسي الفجوات. ثم ضع شرائح الغطاء ووجهها لأسفل فوق قطرات الأجسام المضادة، واتركها لتحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. عند اكتمال فترة التحضين مع الأجسام المضادة الثانوية، أعد شرائح الغطاء إلى الفجوات واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBST.

أخيراً، قم بتثبيت شرائح التغطية باستخدام كاشف Prolong Gold المضاد للتلاشي، ثم احتضنها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لتجف قبل تصوير الخلايا المثبتة باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). يُعد PJ 34 مادة phant rodine مستقرة وقابلة للذوبان في الماء، وقد لوحظ سابقاً أنها تقضي حصرياً على الخلايا السرطانية التي تحتوي على مراكز جسيمات متعددة دون الإضرار بالخلايا الطبيعية التي تمر بمرحلة الانقسام الفتيلي وتملك مركزين جسيميين ومغازل ثنائية البؤرة. في هذه الدراسة، تم فحص النشاط السام للخلايا لمركب PJ 34 باستخدام خلايا سرطان الثدي البشرية الحية M-D-A-M-B 231، والتي تتميز بحدوث مرتفع للمراكز الجسيمية الإضافية.

تم ترنسفكشن الخلايا ببروتين gamma tubulin GFP لوسم بؤر gamma tubulin، وببروتين histone H two B red لوسم الكروموسومات. وقد كشف فحص خلايا M-D-A-M-B 231 لمدة 16 ساعة على الأقل باستخدام التصوير البؤري (confocal imaging) عن تكتل ثنائي البؤر للمراكز الجسيمية، وهو ما يمثل تكتلاً ثنائياً لبؤر مراكز جسيمية إضافية في غالبية الخلايا في مرحلة الانقسام الفتيلى، كما هو موضح في مقاطع الفيديو التالية. يظهر الفيديو الأول خلية حية مختارة عشوائياً أثناء الانقسام الفتيلى مع وسم المراكز الجسيمية باللون الأخضر بواسطة gamma tubulin.

يتم تصور إعادة ترتيب الكروموسومات أثناء الانقسام الفتيل في الفيديو الثاني باستخدام GFP في خلية M-D-A-M-B 231 مختارة عشوائياً ومعدلة وراثياً ببروتين histone H two B red. أما الفيديو الثالث فهو لخلية MDA MB 231 تمر بمرحلة الانقسام الفتيل، حيث تظهر بؤر الـ centrosomes العنقودية ثنائية البؤرة ملونة باللون الأخضر والكروموسومات ملونة باللون الأحمر. وفي المقابل، تم رصد centrosomes غير عنقودية وترتيب غير طبيعي للكروموسومات في خلايا M-D-A-M-B 231 حية ومعدلة وراثياً تم تحضينها مع 20 micromolar من PJ 34، وقد انتهى الانقسام الفتيل في هذه الخلايا بموت الخلية كما هو موضح في هذا المقطع.

يدعم هذا التوثيق في الوقت الحقيقي لموت الخلايا أثناء الانقسام الفتيلة بقوة وجود ارتباط إيجابي تم تحديده مسبقاً بين عدد الخلايا الخبيثة البشرية ذات المغازل متعددة الأقطاب في الانقسام الفتيلة ونسبة موت الخلايا التي تم تحضينها باستخدام PJ 34. ونظراً لأن PJ 34 يعمل كمثبط قوي لـ PARP one، فقد تم استقصاء احتمالية أن يؤدي تثبيط PARP one إلى موت الخلايا المرتبط بفشل الانقسام الفتيلة. تم اختبار النشاط السام للخلايا لتركيزات متزايدة من PJ 34 في الخلايا الليفية الجنينية للفئران الطبيعية وتلك التي تعاني من نقص في PARP one، والنتائج معروضة هنا.

يوضح الرسم البياني الموجود على اليسار النسبة المئوية للمغازل متعددة البؤر التي تم حسابها في الأرومات الليفية الجنينية للفئران الطبيعية والممثلة بالخط الأسود، والأرومات الليفية التي تفتقر إلى PARP one والممثلة بالخط الرمادي، والتي تم تحضينها لمدة 48 ساعة مع PJ 34 بالتركيزات الموضحة. وقد تم حساب هذه النسب المئوية من إجمالي 20 مغزلاً تم رصدها في ثلاث تجارب مختلفة. أما الرسم البياني الموجود على اليمين فيوضح معدل بقاء الأرومات الليفية الجنينية للفئران الطبيعية وتلك التي تفتقر إلى PARP one بعد تحضينها لمدة 72 ساعة مع 20 micromolar.

تم تقييم بقاء خلايا PJ 34 من خلال قياس إنتاج ATP في الخلايا. وتُعرض القيم المتوسطة لأربعة قياسات لكل خط خلوي في ثلاث تجارب مختلفة. وتظهر هذه النتائج أن جرعات PJ 34 تسببت، بشكل يعتمد على الجرعة، في تشوه المغازل وموت الخلايا في الأرومات الليفية الجنينية للفئران التي تعاني من نقص في PARP one، ولكن ليس في الأرومات الليفية الطبيعية.

إن حقيقة قيام PJ 34 بالقضاء على خلايا mEPS الناقصة في إنزيم PARP1 رغم نقص هذا الإنزيم لديها، والارتباط بين تكوين المغازل متعددة البؤر والقضاء على الخلايا في الأرومات الليفية الجنينية للفئران الناقصة في إنزيم PARP1 عند تحضينها بـ PJ 34 بتركيزات أعلى من تلك المطلوبة لتثبيط PARP1، لا يتسق مع وجود صلة سببية بين إزالة التكدس من الجسيمات المركزية في الأرومات الليفية الجنينية للفئران الناقصة في PARP1 وبين تثبيط PARP1. تُظهر صور المجهر البؤري هذه أرومات ليفية جنينية للفئران طبيعية وأخرى ناقصة في PARP1 في مرحلة الانقسام الفتيلى، حيث تم تثبيتها ونفاذيتها ووسمها مناعياً لكل من alpha tubulin و gamma tubulin اللذين لونا مغازلها باللون الأخضر والجسيمات المركزية باللون الأحمر على التوالي. كما لونت الكروموسومات باللون الأزرق باستخدام كاشف DPI.

تركت الخلايا إما بدون معالجة أو حُضنت مع PJ 34 لمدة 48 ساعة بالتركيزات الموضحة. لُوحظت بؤر gamma tubulin غير متجمعة، وتشوهات في المغازل، وموت خلوي في الخلايا الليفية الجنينية للفئران التي تفتقر إلى PARP one والمعالجة بـ PJ 34، بينما لم يُلاحظ ذلك في الخلايا الليفية الجنينية الطبيعية للفئران المعالجة بـ PJ 34. عولجت بعض المزارع الخلوية التي تم فحصها بمثبطين قويين لـ PARP one غير مشتقين من النيكوتيناميد، وهما BT 8 88 و G 0 1 4 6 9، واللذان يثبطان النشاط الإنزيمي لـ PARP one.

لم يؤدِّ أي من مثبطات PARP one المختبرة إلى إضعاف الخلايا الليفية الجنينية الطبيعية للفئران عند تركيزات تثبط نشاط PARP one. كما لم تؤثر مثبطات PARP one هذه على تكتل الجسيمات المركزية في الخلايا الليفية الجنينية للفئران التي تعاني من نقص في PARP one. وتشير هذه النتائج إلى أن النشاط السام للخلايا لمركب PJ 34 في الخلايا ذات الجسيمات المركزية المتعددة لم يكن مشتركاً مع مثبطات PARP one القوية الأخرى بمجرد إتقان الطريقة.

يمكن استخدام هذه التقنية في أنواع أخرى من الخلايا الحية لمجموعة متنوعة من المقترحات.