العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل ووسم الخلايا المتعادلة (neutrophils) من نخاع عظم الفأر لإجراء الدراسات الوظيفية اللاحقة وتجارب النقل التكيفي. يتم تحقيق ذلك من خلال جمع خلايا نخاع العظم أولاً من عظام الفخذ وظنبوب الفأر. وفي الخطوة الثانية، يتم تحلل كريات الدم الحمراء أسموزياً عن طريق تعليقها بالتتابع في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.2% ثم 1.6% على التوالي.

بعد ذلك، يتم عزل الخلايا المتعادلة عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة. وفي الخطوة النهائية، يتم وسم الخلايا المتعادلة باستخدام صبغات تتبع الخلايا. وفي النهاية، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد الخلايا المتعادلة المنقولة تكيُّفياً والتي تم استقطابها إلى أنسجة الفأر المختلفة.

تتمثل الميزة الرئيسية لعزل الخلايا المتعادلة للفئران من نخاع العظم مقارنة بالدم أو الصفاق في إمكانية الحصول على عدد كبير من الخلايا الكافية للدراسات الوظيفية اللاحقة وتجارب النقل التبني، وذلك من نخاع العظم سواء في الحالة المستقرة أو بعد العدوى. وتكمن ميزة استخدام تقنية الطرد المركزي المتدرج لعزل الخلايا المتعادلة للفئران مقارنة بالاختيار المناعي المغناطيسي أو فرز الخلايا المنشط فلوريسنتياً في أنها سريعة واقتصادية وتتجنب وسم الخلايا المتعادلة بالأجسام المضادة التي قد تحفز تنشيط الخلايا المتعادلة. سيقوم موكا سوامي، وهو فني من مختبري، بشرح الإجراء بعد رش فأر تم تخديره حتى الموت بـ 70% ethanol.

أجرِ شقاً في المنطقة الوسطى من بطن جلد الحيوان، ثم أزل أنسجة الجلد من الجزء القاصي للحيوان، بما في ذلك الأطراف السفلية. بعد ذلك، استخدم المقص لقطع العضلات من الأطراف الخلفية للحيوان، ثم قم بخلع عظمة ACE بعناية من مفصل الورك، مع تجنب كسر رأس عظمة الفخذ. ثم استخدم المقص والمشرط لإزالة العضلات المتبقية من عظم الفخذ وعظم الظنبوب.

افصل عظام الساق عند مفصل الركبة، مع الحرص على عدم كسر نهايات العظام، ثم ضع العظام في طبق بتري يحتوي على وسط RPMI 1 6 4 oh بارد جداً (مثلج). أضف مصل الجنين البقري (FBS) والمضادات الحيوية. انقل الطبق إلى غطاء زراعة الأنسجة، ثم قم بتعقيم السطح الخارجي لكل عظمة باستخدام إيثانول 70% في طبق بتري جديد.

بعد حوالي 10 إلى 15 ثانية، اشطف الإيثانول من سطح كل عظمة بثلاث غسلات متتالية باستخدام PBS معقم ومبرد بالثلج. بعد ذلك، اقطع المشاشة من كل عظمة وضعها في طبق بتري معقم جديد. ثم، قم بتركيب إبرة قياس 25 على محقنة سعة 12 cc مملوءة بـ 10 milliliters من RPMI.

يُضاف FBS وEDTA كمكملات. بعد ذلك، تُغسل خلايا نخاع العظم من كلا طرفي ساق كل زوج من عظم الفخذ والظنبوب في أنبوب Falcon سعة 50 milliliter ذو غطاء لولبي، ومزود بمرشح 100 micrometer لإزالة جميع الخلايا. تُكشط الأسطح الداخلية للعظام باستخدام طرف الإبرة.

عندما تبدو العظام مبيضة، يكون قد تمت إزالة الخلايا بشكل كافٍ. الآن، استخدم مشرطاً لتقطيع مشاش العظام إلى قطع صغيرة يتراوح حجمها من 0.5 إلى 1 ملم، ثم استخدم الطرف الخلفي لطرف ماصة BioPure من نوع einor comb بسعة 2.5 مل لسحقها عبر مرشح 100 ميكرومتر. بعد طرد الخلايا المحصودة مركزياً لمدة سبع دقائق عند 427 ×g ودرجة حرارة 4 °C، يتم غسل خلايا الدم الحمراء في 20 مل من كلوريد الصوديوم بتركيز 0.2% لمدة 20 ثانية تقريباً.

بعد ذلك، أوقف عملية التحلل بإضافة 20 milliliters من كلوريد الصوديوم بتركيز 1.6%، وقم بطرد الخلايا مركزياً، ثم أعد تعليق الراسب في وسط RPMI 1 6 4 oh المكمل بـ FBS و EDTA. قم بعدّ الخلايا، وبعد طردها مركزياً مرة أخرى، أعد تعليق الراسب المغسول بتركيز لا يتجاوز 100 times 10 to the six cells per one milliliter من PBS المعقم والمبرد على الثلج. والآن، قم بتوزيع 3 milliliters من his opaque 1 1 1 9 بدرجة حرارة 18 to 26 degree Celsius في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliters، ثم أضف ببطء 3 milliliters بدرجة حرارة 18 to 26 degree Celsius كطبقة علوية.

في محلول Ficoll-Paque 1077، ولتجنب خلط الكثافتين مباشرة بعد التحضير، قم بإضافة معلق خلايا نخاع العظم بعناية فوق طبقة Ficoll-Paque 1077. قم بطرد تدرج الكثافة مركزياً لمدة 30 دقيقة عند 834 ×g و 25 °C بدون كبح (without the break)، ثم اجمع الخلايا المتعادلة (neutrophils) من السطح الفاصل بين طبقتي Ficoll-Paque 1119 و 1077. بعد غسل الخلايا المتعادلة المجمعة مرتين في وسط RPMI 1640 المضاف إليه FBS والمضادات الحيوية، قم بإعادة تعليق الخلايا بتركيز 5 × 10⁶ خلية/mL في محلول PBS مسخن مسبقاً إلى 37 °C.

بعد عد الخلايا، احتفظ بجزء صغير من كل عينة تجريبية لتحديد النقاء والحيوية عن طريق قياس التدفق الخلوي، ثم قم بصبغ الخلايا المتعادلة المتبقية بصبغة تتبع الخلايا (cell tracker dye) بتركيز نهائي قدره 5 µM لمدة 10 دقائق عند 37 °C في حمام مائي هزاز في الظلام. وأخيراً، اغسل الخلايا مرتين باستخدام وسط RPMI 1640 المبرد بالثلج والمكمل بـ FBS والمضادات الحيوية لتجنب التلوث المتبادل للصبغة قبل خلط مجموعات الخلايا المتعادلة المصبوغة بشكل تفاضلي لإجراء دراسات إعادة التوطين التنافسية اللاحقة؛ تظهر في هذه اللوحة مخططات تمثيلية لقياس التدفق الخلوي للخلايا المتعادلة المعزولة من نخاع العظم والمفصولة بتدرج الكثافة من فأر C57BL/6 غير مصاب. يوضح هذا الجزء البوابة الأولية (initial gating) المستخدمة لخلايا نخاع العظم التي تم جمعها من الواجهة الفاصلة بين Histopath 1119 وHistopath 1077.

يتم استخدام تشتت الضوء الأمامي والجانبي لإثبات أن الخلايا المتعادلة المفصولة بواسطة تدرج الكثافة تزيد نقاوتها عن 90% وتتجاوز حيويتها 95% لمدة أربع ساعات على الأقل بعد النقل التبني. يمكن تتبع الخلايا المتعادلة الموسومة بـ DIA بواسطة قياس التدفق الخلوي في أنسجة مختلفة من الفأر. على سبيل المثال، في الدم ونخاع العظم والكلى للفأر من سلالة C 57 black six المتلقي والمصاب بـ candida كما هو موضح في هذه التجربة، ومن خلال تحديد بوابات الخلايا الحية CD 45 LY six G CD 11 B، يمكن تمييز هذه الخلايا المتعادلة الممثلة والمنقولة تبنياً والموسومة بـ C-M-T-M-R عن الخلايا المتعادلة الأصلية السلبية لـ C-M-T-M-R و PE في الفأر المتلقي من خلال تعبيرها عن PE.

بمجرد إتقان العملية، يمكن إتمام عزل ووسم الخلايا المتعادلة من نخاع عظم الفأر في غضون ثلاث ساعات.