المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

الهدف العام من التجربة التالية هو إدخال مسبار معلوماتي واحد في المستقبلات المقترنة بالبروتين G المستهدفة لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية لمعقدات الإشارات. ويتم تحقيق ذلك عن طريق ترنسفكشن الخلايا بالبلازميدات اللازمة للتعبير عن الآلية الترجمية المطلوبة لدمج الحمض الأميني غير الطبيعي zeto، أو phenylalanine، أو zeto fee في مستقبل GPCR مُعبر عنه. ويمكن بعد ذلك تطبيق متغير GPCR zeto fee بثلاث طرق مختلفة لاستقصاء بنية المستقبل ووظيفته.

أولاً، يُستخدم zeto fee كعامل ربط تشابكي يتم تنشيطه ضوئياً في GPCR، مما يتيح تحديد موقع ارتباط الليجاند المسمى بالتريتيوم. بعد ذلك، يمكن استخدام zeto fee كمقبض كيميائي تفاعلي من أجل ربط ببتيد مقترن أو مسبار فلوري بـ GPCR عبر كيمياء الوسم المتعامدة حيوياً؛ وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها استخدام المسبار الجزيئي zeto fee في الربط التشابكي الضوئي الموجه، ووسم الحاتمة الموجه، والوسم الفلوري لـ GPCRs استناداً إلى طرق الخلايا الحية والطرق الكيميائية الحيوية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام ليجاندات الألفة الضوئية أو وسم السيستين، في المرونة المتاحة لإدخال حمض أميني غير طبيعي وتفاعلي وخامل بيولوجياً وهو P zeto phenol alanine في موقع محدد ومعلوم في المستقبل المستهدف.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إشارات GPCR، بما في ذلك تحديد مواقع التفاعل في معقد المستقبل و LIG ضمن بيئة الغشاء الأصلية، وتسهيل دراسات الفلورة للجزيء الواحد من خلال تحديد المواقع في A-G-P-C-R القابلة للوسم بالتفاعلات الحيوية المتعامدة. ثالثاً، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول الآلية الجزيئية لمستقبلات البروتين G، كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية والغشائية. قبل البدء في هذه التجربة، يتم الحفاظ على خلايا HEC 2 9 3 T في وسط KO's modified eagle medium، المدعم بـ 10% fetal bovine serum عند 37 °C في جو يحتوي على 5% CO2.

قم بنقل الجينات إلى الخلايا عند وصول نسبة التلاقي إلى 60 إلى 80% في طبق بقطر 10 سنتيمتر باستخدام G pcr و r CD و NA باستخدام كاشف lipectomy plus وفقاً لما هو موضح في البروتوكول المكتوب. وفي اليوم التالي، استبدل وسط النمو بوسط DMEM المحتوي على 10% FBS و 0.5 millimolar fee. وبعد مرور 48 ساعة على عملية نقل الجينات، قم بتحليل التعبير الجيني كما هو موضح في النص.

انتقل إلى إجراءات التصوير أو الربط التشابكي أو الوسم كما هو موضح في بقية هذا الفيديو. بعد 48 ساعة من عملية عفن الخلايا (transfection)، يتم سحب الوسط من الخلايا واستبداله بـ 4 mL من محلول الفوسفات المنظم (PBS) بتركيز 1x، ثم تُعاد الخلايا إلى درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة لضمان انفصال الخلايا عن الطبق. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق الخلايا باستخدام 1x PBS ونقلها إلى أنبوب Falcon، ثم تُفصل باستخدام جهاز الطرد المركزي بسرعة 1500 RPM لمدة دقيقتين.

لترسيب الخلايا، يتم سحب السائل الطافي قبل إعادة تعليق كتلة الخلايا المترسبة في محلول هانكس الملح المصنّع (Hanks buffered salt solution) بتركيز 1x، والذي يحتوي على الليجاند المشع بالتريتيوم بتركيز ربط مشبع كما تم تحضيره في البروتوكول المكتوب. تُحضن الكتلة المترسبة عند 37 °C للمدة الزمنية المطلوبة لضمان تكوين معقد المستقبل والليجاند، وهي مدة تعتمد على نوع المستقبل والليجاند المحدد. بعد ذلك، يتم نقل معلق الخلايا إلى طبق يحتوي على 24 بئراً أو 96 بئراً.

بعد ذلك، قم بتنشيط zeto fee ضوئياً باستخدام مصباح فوق بنفسجي بطول موجي 365 nanometers لمدة 15 minutes عند درجة حرارة 4 °C، مع الحفاظ على الطبق فوق الثلج لتجنب تسخين العينة وتحلل الخلايا. بعد التنشيط الضوئي، انقل الخلايا إلى أنبوب einor وقم بالطرد المركزي لترسيب الخلايا. قم بإزالة السائل الطافي ثم انتقل إلى مرحلة التحليل.

أعد تعليق كتلة الخلايا في محلول التحلل (lysis buffer)، ثم حضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بطرد مستخلص الخلايا مركزياً لمدة 10 دقائق عند 16,000 ×g. وقبل نقل الراشح إلى أنبوب جديد، أضف 1D4 monoclonal antibody modified SROs 2B resin إلى الراشح وحضنه طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C لتنقية GPCR مناعياً باستخدام 1D4 monoclonal antibody epitope المهندسة في الطرف الكربوكسيلي (C terminus). وفي اليوم التالي، اغسل الحبيبات عدة مرات باستخدام محلول التحلل. ثم قم باستخلاص العينات باستخدام 1% SDS عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة مع الرج.

انقل جزءاً من EENT إلى قارورة سعة 15 milliliter تحتوي على سائل وميضي، ثم قم بالعد باستخدام عداد وميض بيتا لتقدير كمية الارتباط النوعي للربيطة الموشومة بالتريتيوم بالمستقبل. قم بفصل ما تبقى من EENT المنقى عن طريق الفصل الكهربائي للهلام القياسي باستخدام هلام SDS بنسبة 4 إلى 12% مع سلم بروتيني قياسي. بعد ذلك، قم بنقله بطريقة النقل شبه الجاف إلى غشاء A-P-V-D-F لإجراء اللطخة المناعية.

قم بحجب غشاء PVDF باستخدام 5% حليب في محلول TBS المنظم الذي يحتوي على 0.05% Tween 20. افحص الغشاء للتأكد من تعبير المستقبل كامل الطول باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة 1D، يليه جسم مضاد ثانوي anti-US IgG مقترن بـ HRP. ثم عالج الغشاء باستخدام كاشف التألق الكيميائي المعزز.

قم بتعريض الغشاء لفيلم التصوير الشعاعي الذاتي لتصوير الحزم. بعد ذلك، اقطع الغشاء باستخدام شفرة حادة لفصل مسار كل عينة، ثم اقطع عند علامات الوزن الجزيئي المحددة. انقل قطع الغشاء إلى قوارير تحتوي على سائل الوميض، ثم قم بقياس كمية التريتيوم في كل قطعة من الغشاء عن طريق العد باستخدام عداد وميض بيتا.

حدد الارتباط التشابكي الضوئي الإيجابي من خلال الكشف عن التريتيوم عند كتلة جزيئية ظاهرة تساوي مجموع كتلة GPCR والرابط. بعد غسل الخلايا وعدّها، قم بمعالجة مسبقة لصفيحة ذات 96 بئراً ذات قدرة ارتباط عالية وقاع شفاف بـ 100 µL من Poly D lycine بتركيز 10 µg/mL لكل بئر، ثم حضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اغسل عدة مرات باستخدام 1x PBS قبل ترك الخلايا لتجف في الهواء، ثم ازرع الخلايا المنقولة في 200 µL بكثافة تتراوح من 60 إلى 80,000 خلية لكل بئر في طبق 96 بئر، وأعدها إلى درجة حرارة 37 °C في جو يحتوي على 5% CO2. في اليوم التالي.

قم بتجهيز الخلايا للوسم. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 100 µL من XPBS لكل بئر لإزالة أي أوساط نمو تحتوي على zeto fee. قم بتحضير محلول منظم يحتوي على 50 إلى 200 µM من كاشف الوسم flag Tri AAL PHOSPHINE كما هو موضح في البروتوكول النصي.

ضع 60 µL في كل بئر. مع الاحتفاظ بمجموعة من الآبار بدون معالجة بالواسم وبدون منظم. كما يجب تضمين عينة ضابطة من GPCR من النوع البري للمقارنة مع تباين GPCR المغذى بـ zeto.

أعد الطبق إلى درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح بين 30 دقيقة وأربع ساعات بعد الحضن. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 100 µL لكل بئر من محلول الحجب (blocking buffer) لإزالة المسمى غير التفاعلي تماماً. بعد ذلك، ضع 100 µL لكل بئر من بارافورمالدهيد بتركيز 4% على الخلايا بعد تحضينها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول الحجب. قم بتنفيذ بروتوكول EISA القياسي لسطح الخلية للكشف عن المستقبل المسمى وتعبيره، وذلك من خلال تحضين الخلايا أولاً مع الجسم المضاد الأولي لمدة 1.5 hours على الثلج. يتبع ذلك تحضين مع الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة one hour.

بعد ذلك، أضف 100 µL من الجسم المضاد Anti-Flag M two المخفف للكشف عن الإبيتوپ الببتيدي لـ flag في كاشف وسم Tri AAL phosphine. كما يجب فحص الآبار التي لم تتعرض للوسم كضابط سلبي.

ثم أضف جسم مضاد anti CCR5 2D7 مُخففاً إلى مجموعات منفصلة من الآبار لتحديد تعبير الخلايا لـ GPCR على السطح في النوع البري أو zeto fee. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول الحجب، ثم احضنها مع 100 µL من جسم مضاد anti-US IgG مُخفف ومقترن بـ HRP.

بعد غسل الخلايا بعناية خمس مرات باستخدام محلول الحجب (blocking buffer)، أضف 50 µL من محلول الكشف (detection buffer) واتركها لتحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أخيرًا، اجمع البيانات الطيفية باستخدام قارئ أطباق الفلورية متعدد الآبار عند طول موجي للإثارة يبلغ 530 nanometers وطول موجي للانبعاث يبلغ 590 nanometers. ابدأ إجراء الوسم عن طريق تحلل 10 مليون خلية محصودة تعبر عن النوع البري (wild type) أو zeto fee.

يتم تحضير تباين أوبسين العصي في 1 mL من محلول التذويب لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. يتم جمع الجزء الرائق بعد طرد مركزي لنواتج تحلل الخلايا عند 15,000 ×g لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، يتم إضافة 100 µL من راتنج spheros 2 B المعدل بالأجسام المضادة أحادية النسيلة 1D4 لالتقاط المستقبل باستخدام حاتمة 1D4 المهندسة في الطرف الكربوكسيلي C terminus.

بعد التحضين لمدة 12 ساعة عند درجة حرارة 4 °C، اغسل الراتنج ثلاث مرات كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، قم بوضع علامة على المستقبل المثبت على مصفوفة الألفة المناعية عن طريق إضافة 0.1 millimolar من fluorescein phosphine ليصل الحجم الإجمالي إلى 0.3 إلى 0.5 milliliters، ثم حضنه لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل إجراء عملية الطرد المركزي بعد إزالة الراشح. اغسل الراتنج لإزالة أي علامات غير متفاعلة، ثم استخلص المستقبل المسمى باستخدام 100 µL من Elian buffer عن طريق التحضين على الثلج لمدة ساعة واحدة.

يتم فصل العينات الموصومة بواسطة SDS page تحت ظروف مختزلة. تُغسل الهلامات لفترة وجيزة في PBS قبل توصيم zeto fee. GPCR عن طريق الفلورة بـ Ingel باستخدام ماسح فلوري بؤري بليزر ذي طول موجي 488 nanometer للكشف عن المستقبل المعدل بـ fluorescein.

استُخدمت منهجية الطفرات بالحمض الأميني غير الطبيعي لإدخال مجسات جزيئية في مواقع محددة في A-G-P-C-R باستخدام تقنية كبح كودون العنبر. ويمكن بعد ذلك استخدام تقنية الربط التشابكي الضوئي لاستقصاء الجوانب الهيكلية لمعقدات ربيطة GPCR في الخلايا الحية، حيث تم استخدام ربيطة جزيئية صغيرة موسومة إشعاعياً بالتريتيوم. واستُخدم Ravi Rock لتحديد موقع ارتباطها على G-P-C-R-C-C-R five.

في هذا المثال، يؤدي التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية (UV) للخلايا التي تعبر عن zeto fee. CCR five variance والمحضنة مسبقاً مع tritiated Ravi. Rock إلى تكوين معقدات مرتبطة تساهمياً يمكن تحديدها باستخدام الوسم الإشعاعي الحساس الموجود على الربيطة.

من بين عدة مواقع في CCR5، تبيّن أن leucine 28 zero fee وtryptophan 86 zero fee قد تمكنا من تكوين روابط تشابكية ضوئية مع Ravi Rock المسمى بالتريتيوم، كما هو موضح من خلال عدادات وميض أعلى بكثير. ولم يُظهر المستقبل من النوع البري أي تشابك مع الليجاند المشع. يمكن استخدام كيمياء الوسم المتعامدة حيوياً لتعديل zero feed بشكل محدد في الموقع C.

تتضمن إحدى استراتيجيات تباين GPCR وسم epitope المستهدف لـ A-G-P-C-R في الخلايا الحية باستخدام ببتيد flag الواسم المقترن بالببتيد. يُستخدم كاشف الوسم Tri AAL PHOSPHINE لإجراء تعديل محدد وانتقائي لـ zeto fee. تمثل بيانات CCR five variance المعروضة هنا بيانات نموذجية من استراتيجية كشف EISA حساسة ومتعددة الخطوات تُستخدم لتحديد المواقع الموُسمة بببتيد flag.

من بين المواقع الموجودة في CCR5، تم فحص جميع زينات (zeto fees). تم التعبير عن متغيرات CCR5 على سطح الخلية، ونجح نصفها تقريبًا في عملية وسم epitope المستهدفة؛ حيث استُخدم النوع البري من CCR5 كضابط سلبي لوسم epitope، وهو ما ظهر من خلال غياب إشارة Anti-Flag. وفي استراتيجية بديلة، تم وسم PCRs لـ zeto feed G المذابة بالمنظفات والمثبتة على مصفوفة ألفة مناعية، مثل الجسم المضاد أحادي النسيلة anti 1D four المقترن براتنج Spheros two B، باستخدام وسم مقترن بـ fluoro four.

تُظهر صورة فلورة Ingel نجاح الوسم الفلوري لبروتين opsin من نوع GPCR في ثلاثة مواضع مختلفة كما هو متوقع، حيث لم يظهر بروتين opsin من النوع البري أي وسم خلفي، وهو ما يتضح من غياب الحزمة الفلورية عند الوزن الجزيئي المتوقع للمستقبل. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تأكيد التعبير الكامل للعدسة لبروتين GPCR المستهدف باستخدام حمض AOL Alanine المحدد والمقدم. بعد تطويره.

سيمهد هذا الأسلوب الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا المستقبلات لاستكشاف أي معقد من المستقبل والمادة الرابطة أو وسم مستقبل مستهدف، وذلك باستخدام الحمض الأميني غير الطبيعي p zeto phenol alanine الذي يتم إدخاله في موقع محدد كمسبار تفاعلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التخليق الحيوي للأحماض الأمينية غير الطبيعية لإدخال مسبار جزيئي في A-G-P-C-R لتسهيل الدراسات البنيوية والديناميكية لمعقدات إشارات GPCR باستخدام تقنيات الربط التصالبي الضوئي المستهدف والوسم البيو-أورثوغونالي.