إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد الببتيدات وتجزئتها مسبقا من مادة رسمية وثابتة وبارافين مدمجة أو FFPE لتحليل البروتينات. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الأنسجة المرغوبة عن طريق التشريح المجهري ، متبوعا بتحلل الخلايا. الخطوة الثانية هي توليد الببتيدات عن طريق معالجة العينات.

باستخدام مرشح الهضم متعدد الإنزيمات بمساعدة تحضير العينة. ثم يتم قياس الببتيدات عن طريق قياس مضان التريتوفان. الخطوة الأخيرة هي تجزئة الببتيدات باستخدام تقنية فصل قوية قائمة على مبادل الأنيون لتجزئة الببتيد.

في النهاية ، تسمح العينات المحضرة بتحليل البروتينات من كميات دقيقة من المواد إلى عمق 10000 بروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الهلام أو هضم المحلول ، هي أنها قابلة للتطبيق على كميات دقيقة من العينات السريرية مثل خلايا الليزر المجهرية. توفر الطريقة عينات تحتوي على ببتيدات مثالية ونقية.

ما الذي يسهل الاستكشاف البروتيني للأنسجة والأمراض البشرية؟ يتكون البروتوكول بأكمله من تقنيات تم تطويرها ونشرها في الماضي. وتشمل هذه المركبات الفائق الاسترداد ، وطرف الماصة ، وتحديد محتوى الببتيد بناء على مضان التربتوفان الذي يوضح أن الإجراء سيكون السيدة

كاتينا استقرت فنيا من مختبرنا لبدء تحضير شرائح الأنسجة لأقسام القطع الدقيقة باستخدام ميكروتوم. سمك الشرائح يعتمد على العينة. عادة ما يعمل التشريح الدقيق بشكل جيد مع شرائح من سبعة إلى 10 ميكرومترات.

بعد تشعيع شرائح الغشاء بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 45 دقيقة ، قم بتركيب الأقسام عليها قبل التجفيف عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. De تقسيم الأقسام المركبة بحضانات متتالية في عبوات متتالية من الزيلين لمدة دقيقتين ونصف ودقيقة ونصف. ثم أعد ترطيب الأقسام على التوالي.

حضانات دقيقة واحدة في الإيثانول المطلق ، 70٪ إيثانول. وأخيرا الماء. بعد تلطيخ الأقسام بالهيماتين من ماير لمدة 20 ثانية.

اشطفها بالماء لمدة دقيقة واحدة واتركها حتى تجف في الهواء. اجمع مجموعة الخلايا ذات الأهمية باستخدام نظام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر. عند استخدام أداة راحة اليد ، اجمع العينات في الأغطية اللاصقة باستخدام ثلاثة ميكرولترات من محلول تحلل الأنسجة ل 10 نانولترات من الأنسجة الدقيقة.

ضع المخزن المؤقت على المادة الدقيقة في الغطاء وأغلق الأنبوب. اجمع التعليق بعد الطرد المركزي القصير. ثم قمل الأنسجة المقطعة على حرارة 99 درجة مئوية في كتلة تسخين مع التحريض لمدة ساعة واحدة.

قم بتوضيح المستخلص الخام عن طريق الطرد المركزي عند 16 ، 000 جم و 18 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. امزج ما يصل إلى 50 ميكرولترا من المحللة المصفاة مع 200 ميكرولتر من محلول UA في وحدة ترشيح فائقة. ثم جهاز الطرد المركزي عند 14 ، 000 GS حتى يبقى أقل من 10 ميكرولتر من المحلول في الفلتر.

عادة ما تتطلب هذه الخطوة من 10 إلى 15 دقيقة من الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بنقل 200 ميكرولتر من محلول UA إلى وحدة الترشيح الفائق وجهاز الطرد المركزي. كما كان من قبل، أفرغ أنبوب التجميع قبل سحب 50 ميكرولترا من محلول I A في وحدة الترشيح الفائق.

تخلط بسرعة 600 دورة في الدقيقة في خلاط حراري في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة وجهاز طرد مركزي. كما كان من قبل ، استمر في خطوات الترشيح الفائق والطرد المركزي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب لهذا الفيديو. ثم انقل وحدات الترشيح إلى أنابيب تجميع جديدة.

ماصة 40 ميكرولتر من عازلة الهضم مع endo proteinase lic C قبل الخلط عند 600 دورة في الدقيقة في الخلاط الحراري لمدة دقيقة واحدة. احتضان الوحدات في غرفة مبللة عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. بعد الطرد المركزي لوحدات المرشح كما هو الحال سابقا، قم بعمل ماصة 160 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقاعدة البيانات وأجهزة الطرد المركزي.

تحتوي وحدات المرشح التي يتدفق المجمع من خلالها على الببتيدات التي تم إطلاقها بواسطة endo protease lic C. بعد ذلك ، تجمع الببتيدات الثلاثية كما هو موضح في بروتوكول النص. يمكن إجراء قياس محتوى الببتيد في هضم البروتين في مخزن مؤقت مخفف لأن بقايا التربتوفان يمكن الوصول إليها بشكل جيد من قبل المذيب. لتحديد كمية الببتيدات ، قم بعمل 0.2 مل من مخزن الفحص العازل DB في الطبيب البيطري الكوارتز Q.

ثم ضع الطبيب البيطري Q في حامل الأدوات qve وسجل طيف الانبعاث للفراغ. قم بإعداد منحنى معايرة باستخدام خطوات 0.1 ميكروغرام عن طريق إضافة جزء واحد من الميكرولتر من محلول التربتوفان القياسي إلى الطبيب البيطري Q وخلطه برفق مع ديسيبل العازلة. بعد تنظيف الطبيب البيطري Q ، قم بسحب العينة وتسجيل طيف العينة.

تابع حساب تركيز البروتين والببتيد كما هو موضح في بروتوكول النص قبل التجزئة. قم بإعداد عمود طرف SAX عن طريق تكديس ست طبقات من EM. استيراد الغشاء الأيوني في طرف ماصة مشترك سعة 0.2 ملليلتر. قم بعمل عمودين لطرف SAX لكل عينة.

بعد ذلك ، قم بإعداد طرف المسرح عن طريق تكديس ثلاث طبقات من M four C 18. في طرف ماصة سعة 0.2 مل، قم بعمل ستة أطراف مرحلية لكل عينة. للبدء.

يخفف التجزئة محاليل الببتيد التي تم الحصول عليها عن طريق الهضم مع ly C مع 0.2 مل من المخزن المؤقت العالمي ل BRI و Robinson. يخفف الرقم الهيدروجيني 11 بالمثل محاليل الببتيد التي تم الحصول عليها عن طريق الهضم باستخدام التربسين مع 0.2 مل من بريطانيا وروبنسون عازلة عالمية. يقوم الرقم الهيدروجيني الخامس بتجميع عمود طرف SAX في غطاء محول أنبوب الطرد المركزي قبل الغسيل وتحقيق التوازن بين عمود طرف SAX ونصائح المرحلة C 18 كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد ذلك ، قم بتجميع عمود طرف SAX في طرف المرحلة C 18. قم بتحميل حلول العينة في أعمدة طرف SAX المتوازنة وقم بالطرد المركزي للأعمدة عند 5,000 Gs لمدة ثلاث دقائق. اغسل أعمدة طرف الماصة ب 0.1 مل من العينات المخففة.

قم بتسهيل التدفق عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 Gs.انقل عمود طرف SAX إلى طرف المرحلة C 18 التالي واستمر في التخلص من الببتيدات كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد غسل أطراف المرحلة C 18 مع 0.05 مل من المخزن المؤقت أ ، قم بمسح الكسور التي تحتوي على 0.05 مل من المخزن المؤقت B في قوارير ، تستخدم لاحقا لحقن العينات في نظام كروماتوغرافيا سائل يتم تجميعه مع ممثل مطياف الكتلة. تظهر هنا نتائج استخلاص البروتين وهضمه.

ينتج عن تحلل 250 نانولترا من الأنسجة ، والذي يتوافق مع مساحة تشريح دقيقة تبلغ 25 ملم مربع من شريحة 10 ميكرومتر ، ما يقرب من 45 ميكروغراما من البروتين الكلي بعد الهضم المتتالي المكون من خطوتين في شكل الصيام مع شريحة البروتياز الإندو C والتربسين ينتج عنه أكثر من 50٪ من إجمالي البروتين. يظهر هنا قياس مضان تمثيلي لمحتوى الببتيد ، وأطياف معيار التريتوفان والعينة تظهر الحد الأقصى عند 350 إلى 360 نانومتر. تتناسب شدة التألق مع محتوى التريتوفان.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات من الأنسجة العالية لتحليل البروتين باستخدام تقنية التشريح الدقيق ومعالجة العينات وتجزئة الببتيد بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات بالإضافة إلى الوقت اللازم لعسر هضم البروتين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام شرائح الأنسجة المعدة حديثا بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البروتينات لاستكشاف بروتينات الأنسجة والخلايا والتشوهات في البشر باستخدام arval في المواد المدمجة الثابتة والبارين.