زرع الخلايا الشمية مغمد لتقييم الانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب المحيطي

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في تقديم نموذج لزراعة الخلايا بناءً على استخدام الخلايا الشمية والخلايا الغمدية في نموذج لإصابة العصب الحنجري. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق قطع العصب الحنجري الراجع وإجراء عملية مفاغرة له، ثم تلي ذلك زراعة الخلايا الشمية والغمدية التي تم الحصول عليها من المخاطية الشمية أو البصلات الشمية.

بعد ذلك، وبمرور شهرين إلى ثلاثة أشهر على الجراحة، يتم تقييم الحيوانات عن طريق تنظير الحنجرة وتخطيط كهربية العضلات. وأخيراً، يتم عزل العصب الحنجري الراجع لإجراء الدراسات النسيجية. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن الخلايا الشمية والخلايا الغمدية تعمل على تحسين إعادة نمو المحاور العصبية للعصب الحنجري الراجع والتعافي الوظيفي للأحبال الصوتية، وذلك من خلال تنظير الحنجرة وتخطيط كهربية العضلات والقياسات النسيجية.

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إصابات الأعصاب الطرفية، والتي تتضمن قياس النمو المحوري والقدرة على تقدير مدى استعادة الوظائف. وبشكل عام، قد يواجه المبتدؤون في هذه الطريقة صعوبة لأن عملية مفاغرة الأعصاب المتكررة تتطلب مهارات في الجراحة المجهرية. بعد إنتاج مستنبتات أولية مُعلمة بـ GFP للبصيلات الشمية (OB) والغشاء المخاطي الشمي (OM) كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، يتم التحضير للجراحة عن طريق تعقيم جميع الأدوات باستخدام الموصدة (autoclave).

بمجرد تخدير الجرذ عن طريق الحقن داخل الصفاق بالكيتامين والكلوربرومازين، تحقق من مستوى التهدئة عن طريق اختبار قرص إصبع القدم. قم بحلاقة موقع الجراحة ووضع الجرذ في وضعية الاستلقاء الظهري، ثم طهر الجلد بغسلات متبادلة من الكحول ومحلول بيتادين. بعد ذلك، قم بتجهيز بيئة جراحية معقمة والحفاظ على الإجراءات التعقيمية طوال فترة الجراحة.

استخدم مشرطاً لإجراء شق جلدي رقبي إنسي بطول سنتيمترين. بعد ذلك، واتباعاً للخط الأبيض الإنسي، قم بإجراء شق عمودي للعضلات تحت اللامية باستخدام مباعد إمساكي بين العضلات تحت اللامية. اكشف الحنجرة ثم العصب الحنجري الراجع أو RLN.

بعد ذلك، وبمساعدة مجهر جراحي، استخدم مقصات دقيقة لقطع العصب بالكامل عند مستوى الحلقة الرغامية السابعة مع غرزة واحدة من خيوط 11 T. قم بإجراء عملية مفاغرة لإلغاء تعصيب الحنجرة قبل عملية الزرع مباشرةً. استخدم 0.05%trypsin EDTA لإزالة خلايا OB و OM من الأطباق.

بعد ذلك، ولإيقاف عملية الهضم، أضف خمسة ملليلترات من الوسط الدافئ بعد طرد الخلايا مركزياً عند 432 G لمدة خمس دقائق. استخدم مقياس كريات الدم (hemocytometer) لعد الخلايا وضبط التركيز الخلوي في هذا النموذج بين 1.2 وستة مضروبة في 10⁶ خلية في 30 µL من D-M-E-M-F 12 داخل أنبوب طرد مركزي دقيق. قم بتحضير نسبة 1:2 من الخلايا إلى عامل النمو وmatrigel المختزل، وضع المزيج على الثلج مباشرة قبل عملية الزرع.

أخرج الأنبوب من الثلج وأمسكه لتدفئة الخليط. وباستخدام ماصة، ضع محلول الماتريجيل الخلوي على موقع المفاغرة واترك الخليط يتجمع ذاتياً على العصب المصاب عند تجمده. استخدم خيوط جراحية مقاس 4-0 لإغلاق العضلات والجلد.

ضع الجرذ في قفص فردي وأبقه تحت مصباح تدفئة لمدة 24 ساعة. قم بإعطاء المسكنات خلال الأيام الخمسة التالية، وذلك بعد حوالي شهرين من الجراحة بعد التخدير. بالنسبة للجرذان الموصوفة سابقاً في هذا الفيديو، استخدم قرصة إصبع القدم للتأكد من التخدير.

ضع الجرذ في وضعية الاستلقاء الظهري قبل إدخال منظار الحنجرة بالفيديو بزاوية 30 درجة، مع ضبط المنظار لتوفير أفضل رؤية للحنجرة لضمان تكرار الرؤية نفسها في كل تسجيل. حدد المعالم التشريحية مثل الصوار الخلفي، والحبل الصوتي الأيمن عند نقطة اتصاله بالنتوء الصوتي للـ OID، والحبل الصوتي الأيسر عند نقطة اتصاله بالنتوء الصوتي للـ oid.

سجل حركات الحبال الصوتية عن طريق اختيار ثلاثة تتابعات من التبعيد الأقصى والتقريب الأقصى المتتاليين. ولتحليل وظيفة الحنجرة، حدد الحركة الزاوية المطلقة عن طريق قياس الفرق بين حركة التبعيد الأقصى والتقريب الأقصى للحبال الصوتية. حدد الدرجة الديناميكية عن طريق قياس سعة الحركة، والدرجة الوظيفية عن طريق قياس الحركات التآزرية والحركات المتناقضة لإجراء تخطيط كهربية العضلات.

ضع قطبًا كهربائيًا على العضلة المأبضية للجرذ بعد كشف الحنجرة والرغامى كما هو موضح في عملية مفاغرة العصب الراجع. اكشف الغضروف الحلقي الدرقي. بعد ذلك، وباستخدام مقص دقيق، افتح الغضروف الحلقي الدرقي لكشف العضلة الحلقية الدرقية الخلفية أو عضلة PCA.

أدخل قطبًا إبريًا أحادي القطب في العضلة بينما يكون الحيوان تحت التنفس التلقائي. استخدم نظام استحواذ لتسجيل النشاط الكهربائي لعضلة الـ PCA. قم بتحليل النشاط العضلي من حيث الثراء والتزامن مع التنفس عن طريق تعيين درجة نوعية من صفر إلى ثلاثة باستخدام المقياس التالي.

تساوي القيمة صفر تتبعاً غير مجرب دون زيادة أثناء الشهيق. وتساوي القيمة واحد تتبعاً متناغماً مع زيادة الشهيق، أما القيمة اثنين فتعني تتبعاً متناغماً مع نشاط أغنى، بينما تساوي القيمة ثلاثة تتبعاً متناغماً غنياً جداً يشكل نمط تداخل مشابهاً للنشاط القصدي الأقصى.

بعد ذلك، ولتجنب إتلاف العصب الحنجري الراجع (RLN) نظراً لصغر حجمه، قم بكشف العصب المبهم، ثم ثبت قطباً كهربائياً وقم بالتحفيز في هذا الموقع. سجل زمن الاستجابة ومدة الجهد في عضلة PCA. وأخيراً، بعد قتل الحيوان رحمةً باستخدام جرعة زائدة من البنتوباربيتال تحت المجهر، حدد موقع المفاغرة، ثم قم بخياطة وإزالة الجزء القاصي من العصب الحنجري الراجع (RLN) الواقع بين المفاغرة والحنجرة.

أجرِ التحليل النسيجي وفقاً للبروتوكول النصي الموضح هنا؛ حيث تُعد عمليات زرع الخلايا من المزارع الأولية للشم والغشاء المخاطي والبصيلات الشمية أمثلة على مخططات EMG التي تم الحصول عليها من عضلة PCA أثناء التنفس. أظهرت حيوانات المجموعة الضابطة نشاطاً عضلياً كهربائياً غنياً مع زيادة أثناء الشهيق، وهو ما لم يكن موجوداً في مجموعة Rerated. وفي هذا الشكل، تظهر التحاليل النسيجية للعصب RLN عن طريق صبغ التولويدين الأزرق مقاطع ألياف نموذجية من الحيوانات الطبيعية والمعاد تعصيبها والمزروعة.

يتيح هذا القياس تقدير كمية الألياف النخاعية، ومتوسط حجم الألياف، ومتوسط سمك النخاعين كما هو موضح هنا. ولاستكمال التحليلات النسيجية، تم تتبع الخلايا الموجبة لـ GFP بعد الزرع داخل العصب في العصب الوركي.

تم اختيار هذا الموقع بدلاً من العصب الوركي المرتد (RLN) لأن صغر حجم الأخير يمنع عملية الزرع داخل العصب. ويمكن إجراء مفاغرة يدوية دقيقة للعصب الطرفي المرتد في غضون 15 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجال إصابات الأعصاب الطرفية لاستكشاف استخدام الزرع الخلوي في نموذج الجرذان.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الخلايا في نموذج إصابة العصب المتكرر، وتقييم الاستعادة الوظيفية للأحبال الصوتية من خلال تخطيط كهربائية العضلات، والتنظير الداخلي المختبري، والقياسات النسيجية.