استخدام الخلوي على الصورة لعرض الكمي من الفطريات الممرضة في جمعية مع الخلايا المضيفة
يونيو 19, 2013
هنا، علينا أن نظهر كيف الخلوي صورة يمكن استخدامها لتقدير حجم الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة في الثقافة. هذه التقنية يمكن استخدامها كبديل للتعداد كفو.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الخمائر المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة دون وحدات تشكيل مستعمرة الطلاء. أولا ، قم بإصابة خلايا البلاعم بكابسة H أو خلايا خميرة C albicans تلطخ خلايا البلاعم المصابة بالبرتقال وبروبيديوم يوديد لتسليط الضوء على خلايا الخميرة القابلة للحياة. ثم باستخدام مقياس التصوير الخلوي ، التقط سلسلة من الصور وقم بتحليل معلمات الحجم والشكل لتعداد خلايا الخميرة بدقة.
يمكن استخدام نتائج قياس الصورة الخلوية بشكل فعال لتحديد الخمائر المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عند إجراء بحث في مجال التسبب في الفطريات ، حيث اضطررت إلى وضع وحدات تشكيل مستعمرة بشكل متكرر وحسابها لقياس كبسولة الفطريات المسببة للأمراض هيستوبلازما كبسولات. الميزة الرئيسية لقياس الخلايا للصورة على الطريقة القياسية لتعداد CFU هي سرعتها المتزايدة لأنها تقضي على خطوات العمل والوقت المكثفة للطلاء واحتضان وعد التخفيفات التسلسلية المتعددة ل CFU عند مقارنة نمو النوع البري والسلالات الطافرة داخل الخلايا المضيفة.
تقضي هذه الطريقة على التحيز المحتمل الناجم عن اختلاف القدرات لبدء نمو الجودة على الوسائط الصلبة. بشكل عام ، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة تحديا من خلال قياس الصورة الخلوية. الأجهزة والبرمجيات.
ابدأ الإجراء عن طريق زراعة الضامة بالكثافة المطلوبة. في 24 لوحة بئر ، أضف الخلايا الفطرية في نمو طور السجل ، ثم احتضن لمدة 90 دقيقة للسماح بالبلعمة. بعد ذلك ، اغسل البلاعم ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الفطريات خارج الخلية التي تحتضن للنقاط الزمنية المحددة تجريبيا قبل تحليل العينة عند تعدد منخفض من العدوى ، وتظل خلايا البلاعم المصابة قابلة للحياة لعدة أيام ، ويمكن تحليل العينات كل 12 إلى 24 ساعة تقريبا.
بعد ثلاث غسلات باستخدام PBS ، أضف 0.5 مل من الماء المعقم إلى خلايا البلاعم المصابة. احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحرير الفطريات من خلايا البلاعم. ثم احصد المحللة إلى أنبوب معقم واحتفظ بها على الجليد.
انقل 20 ميكرولترا من المحللة إلى أنبوب منفصل. أضف 20 ميكرولتر من محلول يوديد البروبيديوم البرتقالي لتحليل القياس الخلوي الفوري للصورة. قم بإجراء تخفيف عشرة أضعاف من المحللات في الوسائط.
ثم لوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في نسختين. على لوحات HMM aros. احتضان الصفائح في غرفة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة إلى ثمانية أيام.
عد المستعمرات يدويا على الألواح ، مع عرض ما لا يقل عن 100 و 1000 مستعمرة مميزة كحد أقصى. لجمع البلاعم الحية ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف 0.5 مل من PBS واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة البلاعم من آبار زراعة الأنسجة عن طريق ماصة لطيفة. انقل السائل إلى أنبوب معقم واحفظه على الثلج. لإعداد أداة مقياس التسارع، أدخل وحدات البصريات الفلورية في النظام وتأكد من تثبيتها في مكانها.
قم بتشغيل مقياس الخلوي للصورة في القائمة المنسدلة للفحص بالبرنامج. حدد نوع المقايسة المحددة مسبقا ونوع الخلية للبقاء. تم تحسين الاختبار للكشف عن البرتقال واليوديد البروبيديوم للكشف عن عدوى المبيضات البيض.
تم تحسين الاختبار للكشف عن GFP. افتح الآن علامة تبويب الخيارات وانقر فوق التقاط صورة خلفية بعد اكتمال العملية ، انقر فوق معاينة صورة الحقل الساطع لقياس جدوى A OPI. امزج 20 ميكرولترا من العينة مع 20 ميكرولترا من A OPI والماصة في غرفة المحاسبة لمعدل عدوى المبيضات البيضاء.
امزج العينة جيدا واتركها مباشرة في غرفة العد. بعد أن تستقر الخلايا في الغرفة ، أدخل غرفة العد في مقياس الخلوي للصورة للحصول على الصورة. اجعل العينة في التركيز ، ثم انقر فوق العدد.
عند اكتمال عملية الحصول على الصورة ، قم بإزالة غرفة العد التي تستخدم لمرة واحدة وتخلص منها بشكل صحيح. بالنسبة لقياس OPI ، يتم عرض نتائج التركيز والجدوى في صفحة نتائج العد لتحديد معدل الإصابة المبيضات البيضاء. بعد الحصول على نتائج العد ، انقر فوق تصدير.
ثم أرسل البيانات إلى FCS express four لتحليل مجموعة الخلايا ل GFP. في FCS express ، قم باستيراد ملف البيانات ورسم النتائج في الرسم البياني الفلوري. بعد ذلك ، قم بتطبيق بوابة تجمع الخلايا على الرسم البياني لتحديد النسب المئوية للخلايا المصابة المبيضات البيضاء
تراقب هذه التجربة نمو خلايا البلاعم المصابة بخميرة اللوتوم hcaps في نقاط زمنية محددة. يتم تلطيخ العينات وتحليلها عن طريق القياس الخلوي القائم على الصور. يتم تحديد خلايا الخميرة المحررة من البلاعم المؤبطة بواسطة برنامج Soter vision.
هنا ، يكون العدد المطلق للخمائر الحية المكتشفة أكبر من الخميرة القادرة على تكوين المستعمرة على وسط صلب. تسلط هذه البيانات الضوء على وجود أعداد كبيرة من الخلايا القابلة للحياة ، ولكن غير القابلة للزراعة. أصيبت هذه البلاعم المشتقة من نخاع العظم بخلايا خميرة C albican التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر تحت سيطرة مروج A DH واحد.
أدت تعدد العدوى التي تتراوح من 0.1 إلى 10 إلى زيادات تدريجية في شدة GFP داخل الضامة المصابة ، بالإضافة إلى النسبة المئوية الإجمالية للضامة المصابة بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في دقائق فقط لكل عينة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تعيين المعلمات بحيث يتم حساب الخلايا الفطرية فقط وليس الخلايا المضيفة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام قياس الخلايا للصور لتحديد الخمائر المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة. لا تنس أن العمل مع الفطريات المسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا ارتد معدات الحماية الشخصية واتبع الإجراءات المناسبة للتخلص من النفايات البيولوجية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة استخدام قياس التدفق الخلوي التصويري لتقدير كمية الفطريات الممرضة المرتبطة بخلايا العائل في المزرعة. وتعد هذه الطريقة بديلاً فعالاً لعملية تعداد الوحدات المكونة للمستعمرات (CFU) التقليدية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- الإمراضية الفطرية
- علم الأحياء الدقيقة الخلوي
- تقنيات التصوير الكمي
خلفية علمية
- يمكن أن يكون تقدير كمية الخمائر الممرضة باستخدام الطرق التقليدية أمراً صعباً.
- يعتبر تعداد الوحدات المكونة للمستعمرات (CFU) عملية مكثفة للعمالة وتستغرق وقتاً طويلاً.
- يوفر قياس التدفق الخلوي التصويري بدلاً أسرع للتقدير الكمي.
- تركز الدراسة على التفاعل بين البلاعم والخمائر الممرضة.
الغرض من الدراسة
- لتقدير كمية الخمائر الممرضة في الخلايا المضيفة دون استخدام طرق عد الوحدات المكونة للمستعمرات (CFU).
- لتحسين كفاءة التقدير الكمي للإصابات الفطرية.
- لتوفير طريقة موثوقة لتحليل التفاعلات بين الخميرة والخلايا.
الطرق المستخدمة
- إصابة خلايا البلاعم بـ H capsulation أو خلايا خميرة C albicans.
- صباغة الخلايا المصابة بصبغة aine orange ويوديد البروبيديوم.
- التقاط الصور باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي التصويري.
- تحليل معالم الحجم والشكل لتعداد خلايا الخميرة.
النتائج الرئيسية
- يعمل قياس التدفق الخلوي التصويري على التحديد الكمي الفعال للخمائر الممرضة داخل خلايا المضيف.
- تقلل هذه الطريقة من الوقت والجهد المبذول في تعداد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU).
- يمكن استخدام النتائج لمقارنة النمو بين السلالات البرية والسلالات الطافرة.
- تعزز هذه التقنية دراسة الإمراضية الفطرية.
الاستنتاجات
- يُعد قياس التدفق الخلوي التصويري بديلاً قابلاً للتطبيق لتعداد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU).
- تعمل هذه الطريقة على تبسيط عملية التكميم للباحثين.
- تفتح هذه الطريقة آفاقاً جديدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد تحديد كمية الفطريات الممرضة في الخلايا المضيفة أمراً بالغ الأهمية للتحقق من أهداف مضادات الفطريات وتحديد المركبات الرائدة في عملية اكتشاف الأدوية المضادة للفطريات. وتعاني طريقة عد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) التقليدية من بطء النمو، وتفاوت كفاءة الزراعة في الأطباق، وسير عمل يتطلب عمالة كثيفة، مما يحد من الإنتاجية في مقارنة السلالات والدراسات الميكانيكية. ويوفر قياس التدفق الخلوي التصويري (Image cytometry) بديلاً سريعاً وحساساً واقتصادياً يتيح التقييم الكمي لحيوية الخميرة والنمو داخل الخلايا دون الحاجة إلى الزراعة في أطباق، مما يدعم الثقة التنبؤية في الفحص الأولي للأدوية المضادة للفطريات في المرحلة قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكّن من استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس نمو الخميرة داخل الخلايا في البلاعم، مما يوضح ديناميكيات التفاعل بين الممرض والمضيف.
- القيمة التشغيلية: توفر تحققاً وظيفياً من الأهداف من خلال القياس المباشر لعبء الخميرة القابلة للحياة في الخلايا المضيفة، مما يقلل الاعتماد على النهايات الطرفية البديلة.
- القيمة التنبؤية: تدعم الثقة التنبؤية وفرز محفظة المشاريع من خلال الكشف عن مجموعات الخميرة القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة والتي تغفل عنها طريقة CFU، مما يحسن دقة مقارنة السلالات.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تحضير أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها (مزارع مشتركة من الخميرة والبلاعم) للفحص اللاحق للمركبات المضادة للفطريات باستخدام بروتوكولات قياسية للعدوى والتحلل.
- المخرجات الكمية: تقديم تعداد قابل للتكرار لخلايا الخميرة بناءً على الحجم والشكل عبر صبغ الأكريدين البرتقالي/يوديد البروبيديوم وقياس التدفق الخلوي التصويري، مما يتيح تقييماً موثوقاً للمركبات.
- القابلية للتوسع: تدعم إعادة استخدام المنصة عبر ممرضات فطرية مختلفة (مثل Histoplasma capsulatum وCandida albicans) وتحليل السلالات الطافرة، مما يعزز إنتاجية عملية الفحص.
الأبحاث الترجمية وقبل السريرية
- الأهمية المرضية: ينمذج المرض الفطري البشري من خلال قياس تضاعف الخميرة في الفجوات البلعمية للبلاعم، بما يتماشى مع استراتيجيات المؤشرات الحيوية الانتقالية لحمل الممرضات داخل الخلايا.
- الاستمرارية قبل السريرية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال توفير مقاييس عدوى كمية بمرور الوقت، مما يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يركز على تقليل المخاطر التنبؤية عن طريق الكشف عن التناقضات بين وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) والعدد الفعلي للخميرة الحية، مما يسلط الضوء على قصور اختبارات الحيوية التقليدية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة اكتشاف مضادات الفطريات، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة واختبار الفعالية قبل السريرية، مما يتيح التقييم الكمي للمركبات المضادة للفطريات في نماذج المضيف والممرض ذات الصلة الفسيولوجية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال قياس كمية بقاء الخميرة وتكاثرها داخل الخلايا المضيفة تحت تأثير الاضطرابات الجينية أو الدوائية.
- الفحص الممنهج: تتيح الجاهزية لإجراء المقايسة من خلال سير عمل موحد للعدوى والتحلل والصبغ، مما ينتج مخرجات كمية قابلة للتكرار لفحص مكتبات المركبات.
- التحليلات: تولد مقاييس تعداد الخميرة وحيويتها بناءً على الحجم والشكل عبر قياس التدفق الخلوي الصوري (image cytometry)، مما يسهل مقارنة الظروف المضادة للفطريات والأنماط الظاهرية للسلالات.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال نمذجة النمو الفطري داخل الخلايا في البلاعم، وهي سمة ضراوة رئيسية في الفطريات الجهازية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كمنصة كمية قابلة لإعادة الاستخدام عبر أنواع الفطريات وأنواع الخلايا المضيفة المختلفة، مما يقلل من تكرار تطوير المقايسات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال الكشف عن مجتمعات الخميرة القابلة للحياة التي لا يتم اكتشافها عن طريق CFU، مما يقلل من الغموض الميكانيكي في دراسات آلية عمل مضادات الفطريات.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال الحصول على الصور وتحليلها بشكل آلي، مما يقلل من التباين المعتمد على المستخدم في عد الخميرة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال توفير حركية عدوى أسرع وأكثر دقة، مما يقلل من استهلاك الوقت والموارد في مراحل الفرز الأولية لمضادات الفطريات.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال تحديد المركبات الفعالة ضد مستودعات الخميرة داخل الخلايا، مما يعالج قصوراً رئيسياً في مضادات الفطريات الحالية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الإمراض الفطري، وزراعة الخلايا البلعمية، والمجهر الفلوري لضمان التمييز الدقيق بين الخميرة والعائل.
- يعتمد على أجهزة قياس التدفق الخلوي بالتصوير (مثل Cellometer Vision) المزودة ببصريات فلورية وبرمجيات تحليل الحيوية للكشف عن acridine orange/propidium iodide و GFP.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق البحثية فيما يتعلق بتوقيت العدوى، وتعدد العدوى (multiplicity of infection)، وبروتوكولات التحلل لضمان تكرار عملية تحرير الخميرة وتقدير كميتها.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع الأنواع الفطرية المختلفة (مثل السلالات التي تعبر عن GFP) وأنواع الخلايا العائلة (مثل الخلايا البلعمية الأولية مقابل الخطوط الخلوية) للحفاظ على خصوصية الإشارة.
- يتقيد بالحاجة إلى تحسين معايير الصبغ والتصوير لاستبعاد إشارات خلايا العائل وتجنب العد الزائد، خاصة في العينات ذات الخلفية العالية.
