القبض في وقت واحد في الوقت الحقيقي الصور في قناتين الانبعاثات باستخدام نظام تقسيم كاميرا مزدوجة الانبعاثات: تطبيقات لخلية التصاق

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء مقايسة التصاق باستخدام غرفة تدفق ذات ألواح متوازية، وذلك باستخدام نظام تقسيم انبعاث ثنائي الكاميرا لتسجيل تتابعات صور في الوقت الفعلي بلونين في آن واحد. ولتحقيق ذلك، يتم أولاً محاذاة الكاميرتين في إعداد التصوير، ثم يتم تحضير الخلايا والركيزة التفاعلية وتجهيز غرفة التدفق ذات الألواح المتوازية.

يتم بعد ذلك معايرة إعدادات الكاميرا لالتقاط صور ثنائية اللون، وإجراء أي تصحيحات رقمية مطلوبة لمحاذاة الكاميرا. ثم يتم التقاط تسلسلات من الصور، والتي توضح عملية الحصول على صور ثنائية اللون بدقة زمنية عالية. وتكمن ميزة أنظمة تقسيم الانبعاث ذات الكاميرا المزدوجة مقارنة بأنظمة الكاميرا الواحدة في إمكانية تعيين أوقات تعريض مختلفة لكل كاميرا مع الاحتفاظ بكامل مجال الرؤية.

يمكن لهذه التقنية أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الالتصاق الخلوي، مثل كيف يمكن لتمركز جزيئات الالتصاق على سطح الخلايا أن يؤثر على العمليات البيولوجية الديناميكية مثل هجرة الخلايا، والالتهاب، وانتشار السرطان. يتطلب الإجراء التالي مجهر فلوريسنت قلبي (inverted epi fluorescence microscope)، ويجب أن يكون مجهزاً بمصدر ضوء عالي الكثافة متصل بدليل ضوئي، ومكعب مرشحات مدمج، ونظام كاميرا مزدوج لتقسيم الانبعاث.

يجب توصيل إعداد المجهر بجهاز كمبيوتر يعمل ببرنامج تصوير قادر على جمع ودمج الصور التي تلتقطها كاميرات CCD أحادية اللون. هنا، يتم استخدام برنامج stream picks five المخصص للكاميرات المتعددة مع وحدة simul picks. ابدأ بفتح برنامج stream picks five، ومن شريط المهام، اختر workspace.

بعد ذلك، وفي أقصى يمين الشاشة، افتح مدير مساحة العمل (workspace manager) وحدد مساحة عمل جديدة (new workspace). بعد تسمية الكاميرا، اتبع مطالبات البرنامج للاختيار من قائمة مجهزة مسبقاً عن أداة التقاط (grabber) مطابقة لطراز الكاميرا، وستظهر أيقونة كاميرا صغيرة في مساحة العمل للإشارة إلى استلام بث الكاميرا. يمكن الآن عرض الأجسام التي يتم تصويرها بالمجهر على الشاشة.

كرر هذه العملية لمساحة عمل الكاميرا الثانية، ثم كررها مرة أخرى لمساحة العمل المدمجة، وبذلك تصبح جميع الكاميرات قيد الاستخدام. ستظهر رسالة خطأ، وهذه الرسالة طبيعية؛ قم بتعيين الكاميرات المخصصة لمساحتي العمل الأولى والثانية إلى مساحة العمل المدمجة في لوحة الإرساء الموجودة على الجانب الأيمن من شاشة العرض.

سيتم تراكب الصور الموجودة في مساحة العمل الأولى والثانية في مساحة العمل المدمجة كصورتين ذات ألوان اصطناعية. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو محاذاة الكاميرا؛ ولضمان النجاح، نستخدم الشريحة المرفقة من الشركة المصنعة مع اتباع تعليمات الشركة المصنعة بدقة.

لمحاذاة الكاميرات في نظام تقسيم الانبعاث ثنائي الكاميرا، قم بتوجيه ضوء المجال المضيء أو ضوء تباين الطور إلى عدسة العين بالمجهر. ضع شبكة المعايرة ذات الطلاء المعدني المقدمة من الشركة المصنعة على منصة المجهر وقم بتسويتها على المنصة. اعرض الشبكة بدون تجميع بكسلي (binning) وبدون تحجيم تلقائي وقم بضبط التركيز، ثم قم بإزاحة مبيت المرشح ثنائي اللون دون إزالته لمحاذاة الكاميرا الأولى.

بعد ذلك، وباستخدام قرص ضبط التركيز في منفذ seamount الأول، قم بضبط تركيز الصورة مرة أخرى. ثم، ادفع مبيت المرشح ثنائي اللون (dichroic housing) بالكامل داخل جهاز الاستحواذ ثنائي القنوات بحيث يتم تقسيم الصورة بواسطة المرشح ثنائي اللون إلى كلتا الكاميرتين. قم بفك براغي التثبيت ذات المقاس 3 5 60 ربع بوصة، وأدر الكاميرا الثانية في منفذ female CM الثاني حتى يصبح توجيه الشبكة متطابقاً في كلتا الصورتين، وباستخدام قرص ضبط التركيز في منفذ C mount الثاني، قم بضبط تركيز الصورة من الكاميرا الثانية.

لإتمام عملية المحاذاة، استخدم مقبض RL الموجود على الجانب الأيمن من DC two لضبط مواضع الصور المدمجة حتى يتم محاذاة الحدود الرأسية للصور بدقة في مساحة العمل المدمجة. بعد ذلك، استخدم مقبض UD لضبط المحاذاة الرأسية (للأعلى والأسفل) للصورة الثانية حتى يتم محاذاة قضبان الشبكة الأفقية بشكل صحيح.

إذا حدث دوران طفيف للكاميرا أثناء عملية المحاذاة الرأسية، فقم بتصحيح هذه المشكلة عن طريق فك البراغي الثلاثة مقاس 1/4 بوصة للكاميرا الثانية وتدويرها حتى يتم محاذاة الصورة المعروضة بشكل صحيح. قم بتجهيز خلايا سرطان الثدي BET 20 لاختبار التصاق غرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية عن طريق صبغها باستخدام anti CD 24 و TECA 4 5 2 باستخدام الأجسام المضادة الثانوية LOR 5 68 و 4 88 كما هو موضح في المستند المرفق، مع التأكد من تجهيز ضوابط اللون الواحد المناسبة؛ بعد الصبغ، قم بتوزيع الخلايا في خزان غرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية. قم بتوصيل أنبوبين منفصلين بمنفذي الدخول والخروج في غرفة التدفق.

سيتم توصيل أحد الأنابيب بالخزان الذي يحتوي على الخلايا الموسومة المعلقة في DPBS بالإضافة إلى 0.1%PSA. قم بتوصيل الأنبوب الآخر بمضخة الحقنة، والتي ستسحب السائل بمعدل تدفق محدد. قم بتوصيل خط تفريغ بغرفة التدفق، وضع غرفة التدفق فوق طبق زراعة الأنسجة بحجم 35 مليمتر الذي يحتوي على طبقة أحادية من خلايا مبيض الهامستر الصيني التي تعبر عن اللكتين أو خلايا cho e.

قم بضبط غرفة التدفق وحاشية غرفة التدفق لضمان إحكام سد الفراغ بشكل كافٍ. اسحب السائل من الخزان مع مراقبة مجموعة غرفة التدفق للتأكد من سلامة السد. وأخيراً، ضع مجموعة غرفة التدفق على المجهر، ثم قم بتشغيل مصدر الضوء وضبط إعدادات المجهر عن طريق الفحص اليدوي.

تأكد من أن مبيت المرشح ثنائي اللون (dichroic housing) في وضع التشغيل المنخفض الصحيح وليس في وضع التجاوز (bypass mode). قم بالتغيير يدويًا إلى وضع الفلورية واختيار مكعب مرشح الفلورية الأخضر والأحمر لتحديد وقت التعريض والكسب بشكل منفصل. قم بتصوير الخلايا باستخدام الفلورية الحمراء في الكاميرا الأولى والفلورية الخضراء في الكاميرا الثانية.

يتم خفض المرشح ثنائي اللون يدويًا حسب الحاجة للحصول على الصور. بعد ذلك، يتم ترسيب معلق من خلايا BT 20 المصبوغة بصبغة red flora فقط. يتم وضع أربعة أجسام مضادة مقترنة في الخزان المتصل بمنفذ الإدخال لغرفة التدفق ذات الألواح المتوازية.

استخدم مضخة الحقن لتروية خلايا BT 20 فوق الطبقة الأحادية من خلايا choi في غرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية. في إعدادات التصوير المباشر لبرنامج التصوير، اضبط وقت التعريض للكاميرا الأولى للحصول على صورة في القناة الحمراء. ثم اجعل وقت التعريض للكاميرا الثانية مطابقًا لوقت التعريض للكاميرا الأولى.

إذا لوحظت صورة في القناة الخضراء، فإن ذلك يشير إلى وجود تداخل لوني (bleed through). في حال حدوث ذلك، حافظ على تعادل وقت التعريض بين الكاميرا الأولى والكاميرا الثانية، ثم قم بتقليل وقت التعريض حتى يختفي التداخل اللوني من القناة الخضراء. يمكن تعديل كسب (gain) الكاميرا الأولى لتحسين وضوح الصورة في القناة الحمراء إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، قم بإزالة أي بقايا من معلق خلايا BT 20 من الخزان واستبدل المعلق بـ DPBS. استخدم مضخة السرنجة لتروية المحلول فوق الطبقة الأحادية من Choi حتى لا تعود خلايا BT 20 مرئية على الطبقة الأحادية. أعد ملء الخزان بمعلق خلايا BT 20 المصبوغة بالأجسام المضادة المقترنة بـ green fluoro four فقط.

كرر عملية معايرة الكاميرا باستخدام عناصر التحكم أحادية اللون الخضراء. في هذه المرة، حدد وقت التعريض بكاميرا 2 لتصوير الخلايا في القناة الخضراء دون حدوث آثار تداخل (bleed through) في القناة الحمراء التي تجمعها كاميرا 1. استخدم برنامج التصوير لعرض الصور الملتقطة من كاميرتي CCD أحادية اللون في غرفة التدفق في وقت واحد.تجربة.

قم بدمج الصور التي تم جمعها من كلتا الكاميرتين باستخدام وحدة simul pics في برنامج stream picks. استخدم تعديلات التصحيح الرقمي في simul pic أو في برنامج بديل لمحاذاة الصور المدمجة مكانياً. وإذا لزم الأمر، يمكن تصحيح الصور باستخدام وحدة simul PIC لإجراء تعديلات أفقية وعمودية ودورانية.

أصبح النظام الآن جاهزاً للاستخدام لالتقاط صورتين ملونتين في آن واحد. وقد استُخدم مقايسة التصاق في غرفة تدفق ذات لوحين متوازيين لاستعراض نظام تقسيم الانبعاث المزدوج للكاميرا الموصوف في هذا الفيديو. وكما هو موضح هنا، فقد رصد النظام خلايا BT 20 التي تم وسمها فلورياً بـ anti-human CD 24 والموضحة باللون الأحمر، و HECA 4 52 الذي يرتبط بجزيئات مرتبطة بـ SCOs والموضحة باللون الأخضر.

أظهرت بعض الخلايا المتدحرجة إشارات حمراء ولكن ليس خضراء، بينما أظهرت خلايا أخرى إشارات خضراء ولكن ليس حمراء، وأظهرت خلايا أخرى كلاً من الإشارات الحمراء والخضراء. حافظت الكاميرات على الدقة البصرية والزمنية لتتبع سمات الخلية أثناء انقلابها وشقلبتها أثناء تدحرجها على الركيزة التفاعلية في اتجاه التدفق؛ وكشفت قنوات الانبعاث المدمجة عن توزيع وتوضع CD 24 وجزيئات sated معاً على سطح خلايا BT 20 التي تتدحرج وتلتصق بطبقات أحادية من CHO e.

تُظهر هذه الصور تكبيراً لخلية واحدة من نوع BT 20، حيث يتوضع كل من CD 24 والجزيئات المصبوغة في نفس الموقع، وتظهر كنقاط صفراء إلى برتقالية عند دمج قنوات الانبعاث ذات الألوان الاصطناعية الحمراء والخضراء. وبشكل عام، تُثبت هذه المعلومات أن نظام تقسيم الانبعاث بكاميرا مزدوجة يمتلك الدقة المكانية والزمانية والبصرية اللازمة للكشف عن السمات الخلوية والجزيئية في تطبيقات مثل مقاييس الالتصاق في غرفة التدفق، حيث تتحرك الخلايا بسرعة عبر مجال الرؤية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إعداد ومعايرة نظام تقسيم الانبعاث بكاميرا مزدوجة أو تصوير مقايسة التصاق في غرفة تدفق ذات لوحين متوازيين في الوقت الفعلي وبلونين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مقايسات أخرى في المختبر تستخدم الفلورة لدراسة سلوك الخلايا.