القبض في وقت واحد في الوقت الحقيقي الصور في قناتين الانبعاثات باستخدام نظام تقسيم كاميرا مزدوجة الانبعاثات: تطبيقات لخلية التصاق
سبتمبر 4, 2013
نظم تقسيم الانبعاثات كاميرا مزدوجة للاللونين مضان المجهري توليد تسلسلات الصور في الوقت الحقيقي مع دقة بصرية والزماني استثنائية، وهو شرط لبعض المقايسات الخلية الحية بما في ذلك بالتوازي المقايسات غرفة تدفق وحة التصاق. عندما يعمل البرنامج لدمج الصور من القنوات الانبعاثات المكتسبة في وقت واحد، ويتم إنتاج تسلسلات الصور pseudocolored.
العام من هذا الإجراء هو إجراء مقايسة التصاق غرفة تدفق اللوحة المتوازية باستخدام نظام تقسيم انبعاثات الكاميرا المزدوجة لتسجيل تسلسلات الصور في الوقت الفعلي بلونين في وقت واحد. للقيام بذلك ، تتم محاذاة الكاميرتين في إعداد التصوير أولا. بعد ذلك ، يتم تحضير الخلايا والركيزة التفاعلية وإعداد غرفة تدفق اللوحة المتوازية.
ثم تتم معايرة إعدادات الكاميرا للحصول على صورتين بالألوان ويتم إجراء أي تصحيحات رقمية مطلوبة لمحاذاة الكاميرا. ثم يتم التقاط تسلسلات الصور ، والتي توضح الحصول على صور مزدوجة اللون بدقة زمنية عالية. تتمثل ميزة أنظمة تقسيم انبعاثات الكاميرا المزدوجة على أنظمة الكاميرا الفردية في أنه يمكن تعيين أوقات تعرض مختلفة لكل كاميرا ويتم الاحتفاظ بمجال الرؤية الكامل.
يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التصاق الخلايا ، مثل كيف يمكن أن يؤثر توطين جزيئات الالتصاق على سطح الخلايا على العمليات البيولوجية الديناميكية مثل هجرة الخلايا والالتهاب ورم خبيث السرطاني. يتطلب الإجراء التالي مجهر مضان epi مقلوب. يجب أن يكون هذا مزودا بمصدر ضوء عالي الكثافة مقترنا بدليل ضوئي ومكعب مرشح مركب ونظام كاميرا مزدوجة لتقسيم انبعاثات الكاميرا.
يجب توصيل إعداد المجهر بجهاز كمبيوتر يعمل ببرنامج تصوير قادر على جمع ودمج الصور الملتقطة بواسطة كاميرات CCD أحادية اللون. هنا ، يتم استخدام خمسة برامج متعددة الكاميرات مع وحدة اختيارات simul. ابدأ بفتح اختيارات الدفق خمسة في شريط المهام ، وحدد مساحة العمل.
ثم في أقصى يمين الشاشة، افتح مدير مساحة العمل وحدد مساحة عمل جديدة. بعد تسمية الكاميرا ، اتبع مطالبات البرنامج للاختيار من قائمة معبأة مسبقا ، طراز كاميرا مطابق للإمساك ، ستظهر أيقونة كاميرا صغيرة في مساحة العمل للإشارة إلى تلقي موجز الكاميرا. يمكن الآن عرض الكائنات التي تم تصويرها بالمجهر على الشاشة.
كرر هذه العملية لمساحة عمل الكاميرا الثانية ، ثم بالنسبة لمساحة العمل المدمجة ، كرر ذلك مرة أخرى وجميع الكاميرات قيد الاستخدام. ستظهر رسالة خطأ. هذه الرسالة هي كاميرات عادية مخصصة من مساحة العمل الأولى والثانية إلى مساحة العمل المدمجة في لوحة الإرساء الموجودة على الجانب الأيمن من شاشة العرض.
سيتم تركيب الصور الموجودة في مساحة العمل الأولى والثانية في مساحة العمل المدمجة كصورتين ملونتين زائفين. أصعب جانب في هذا الإجراء هو محاذاة الكاميرا. لضمان النجاح ، نستخدم شريحة الشركة المصنعة مع اتباع تعليمات الشركة المصنعة بدقة.
لمحاذاة الكاميرات في نظام تقسيم انبعاثات الكاميرا المزدوجة، أرسل ضوء تباين المجال الساطع أو الطور إلى عدسة المجهر. ضع شبكة المعايرة المطلية بالمعدن التي تم توفيرها من قبل الشركة المصنعة على مرحلة المجهر وقم بتربيع الشبكة على مرحلة المجهر. اعرض الشبكة بدون تجميع وبدون تغيير حجم تلقائي وقم بتركيزها ثم قم بإزاحة ، ولكن لا تقم بإزالة الغلاف ثنائي اللون لمحاذاة الكاميرا الأولى.
ثم باستخدام قرص ضبط التركيز البؤري على منفذ الجبل البحري الأول ، قم بتركيز الصورة مرة أخرى. بعد ذلك ، ادفع الغلاف ثنائي اللون إلى جهاز الحصول على القناة المزدوجة بالكامل بحيث يتم تقسيم الصورة بواسطة ثنائي اللون إلى كلتا الكاميرتين. قم بفك مسامير الضبط 3 5 60 بوصة الرابعة وقم بتدوير الكاميرا الثانية على منفذ تثبيت CM الأنثوي الثاني حتى يتطابق اتجاه الشبكة في كلتا الصورتين باستخدام قرص ضبط التركيز البؤري على منفذ التثبيت C الثاني ، وجلب الصورة من الكاميرا الثانية إلى التركيز.
لإنهاء المحاذاة ، استخدم مقبض RL على الجانب الأيمن من DC two لضبط مواضع الصورة المجمعة حتى الرفع الأيمن. تتم محاذاة الحدود الرأسية للصور بدقة في مساحة العمل المدمجة. ثم استخدم مقبض UD لضبط المحاذاة لأعلى لأسفل للصورة الثانية حتى تتم محاذاة أشرطة الشبكة الأفقية بشكل صحيح.
إذا حدث دوران طفيف للكاميرا أثناء المحاذاة لأعلى لأسفل، فقم بتصحيح هذه المشكلة عن طريق فك البراغي 3 5 60 بوصة للكاميرا الثانية وتدويرها حتى تتم محاذاة الصورة المعروضة بشكل صحيح. قم بإعداد خلايا سرطان الثدي BET 20 لمقايسة التصاق غرفة تدفق اللوحة المتوازية عن طريق تلطيخها بمضاد CD 24 و TECA 4 5 2 باستخدام LOR 5 68 و 4 88 الثانوية كما هو موضح في المستند المصاحب ، تأكد من إعداد عناصر التحكم ذات اللون الفردي المناسبة بعد تلطيخ توزيع الخلايا في خزان غرفة تدفق اللوحة المتوازية. قم بتوصيل طولين منفصلين من الأنابيب بمنافذ المدخل والمخرج لغرفة التدفق.
سيتم توصيل أنبوب واحد بالخزان الذي يحتوي على الخلايا المسماة المعلقة في DPBS بالإضافة إلى احتوائه على 0.1٪ PSA. قم بتوصيل الأنبوب الآخر بمضخة الحقنة ، والتي ستسحب السائل بمعدل تدفق محدد. قم بتوصيل خط فراغ بغرفة التدفق وضع غرفة التدفق فوق طبق زراعة الأنسجة 35 ملم الذي يحتوي على طبقة أحادية من خلايا مبيض الهامستر الصينية التي تعبر عن خلايا الليكتين أو cho e.
اضبط غرفة التدفق وحشية غرفة التدفق لضمان ختم فراغ مناسب. اسحب السائل من الخزان لمراقبة مجموعة غرفة التدفق للحصول على الختم المناسب. أخيرا ، ضع مجموعة غرفة التدفق على طاقة المجهر على مصدر الضوء وإعداد المجهر عن طريق الفحص اليدوي.
تأكد من أن الهيكل ثنائي اللون في وضع التشغيل المكتئب الصحيح وليس في وضع الالتفافي. قم بالتغيير يدويا إلى وضع التألق وحدد مكعب مرشح التألق الأحمر الأخضر لتحديد وقت التعرض والكسب بشكل منفصل. قم بتصوير الخلايا باستخدام التألق الأحمر في الكاميرا الأولى والتألق الأخضر في الكاميرا الثانية.
اضغط يدوياعلى ثنائي اللون حسب الحاجة للحصول على الصور. بعد ذلك ، قم بإيداع تعليق خلايا BT 20 الملطخة بالنباتات الحمراء فقط. أربعة أجسام مضادة مترافقة في الخزان متصلة بمنفذ مدخل غرفة تدفق اللوحة المتوازية.
استخدم مضخة الحقنة لنشر خلايا BT 20 فوق الطبقة الأحادية choi في غرفة تدفق اللوحة المتوازية. في الإعدادات الحية لبرنامج التصوير ، اضبط وقت التعرض للكاميرا الأولى للحصول على صورة في القناة الحمراء. قم بمطابقة وقت التعرض للكاميرا الثانية مع وقت التعريض الضوئي للكاميرا الأولى.
إذا لوحظت صورة في القناة الخضراء ، فهناك نزيف من خلال القطع الأثرية. إذا حدث ذلك، فاحتفظ بوقت التعريض الضوئي مكافئا في الكاميرا الأولى والكاميرا الثانية وقلل وقت التعريض الضوئي حتى يصبح النزيف من خلال الأداة مرئيا في القناة الخضراء. اضبط كسب الكاميرا الأولى لتحسين رؤية الصورة في القناة الحمراء إذا لزم الأمر.
بعد ذلك ، قم بإزالة أي تعليق خلية BT 20 متبقي من الخزان واستبدل التعليق ب DPBS. استخدم مضخة الحقنة لنشر المحلول فوق طبقة تشوي أحادية الطبقة حتى تختفي خلايا BT 20 مرئية على الطبقة الأحادية. أعد ملء الخزان بتعليق خلايا BT 20 الملطخة بجسم مضاد مترافق بالفلورو الأخضر فقط.
كرر عملية معايرة الكاميرا باستخدام عناصر التحكم باللون الفردي باللون الأخضر. هذه المرة حدد وقت التعرض مع الكاميرا الثانية لخلايا الصورة في القناة الخضراء دون تسييل من خلال القطع الأثرية في القناة الحمراء التي تم جمعها بواسطة الكاميرا الأولى. استخدم برنامج التصوير لعرض الصور الملتقطة في نفس الوقت من كاميرتي CCD أحادية اللون في غرفة التدفق. التجربه.
ادمج الصور التي تم جمعها من كلتا الكاميرتين باستخدام وحدة simul pics الخاصة باختيارات البث. استخدم تعديلات التصحيح الرقمي في صورة متزامنة أو برامج بديلة لمحاذاة الصور المدمجة مكانيا. إذا لزم الأمر ، يمكن تصحيح الصور باستخدام وحدة الموافقة المسبقة عن علم simul لإجراء تعديلات أفقية ورأسية ودورانية.
النظام جاهز الآن للاستخدام لالتقاط صورتين ملونتين في وقت واحد. تم استخدام مقايسة التصاق غرفة تدفق اللوحة المتوازية لتوضيح نظام تقسيم انبعاث الكاميرا المزدوجة الموصوف في هذا الفيديو. كما هو موضح هنا ، اكتشف النظام خلايا BT 20 التي تم تصنيفها بالفلورسنت باستخدام CD 24 المضاد للإنسان الموضح باللون الأحمر و HECA 4 52 ، والذي يرتبط بالجزيئات ذات الصلة بمنظمات SCO الموضحة باللون الأخضر.
عرضت بعض الخلايا المتدحرجة إشارات حمراء ولكن ليست خضراء. عرض آخرون إشارات خضراء ولكن ليس إشارات حمراء ، ومع ذلك عرضت خلايا أخرى إشارات حمراء وخضراء. هنا. حافظت الكاميرات على الدقة البصرية والزمنية لتتبع ميزات الخلية على خلية متدحرجة وفوق النهاية أثناء تدحرجها على الركيزة التفاعلية في اتجاه التدفق كشفت قنوات الانبعاث المدمجة عن توزيع وتحديد موقع CD 24 والجزيئات المشبعة على سطح خلايا BT 20 التي تتدحرج وتلتصق بطبقات أحادية CHO e.
تظهر هذه الصور تكبيرا لخلية BT 20 واحدة تتشارك فيها CD 24 والجزيئات المشبعة وتظهر على شكل بقع صفراء إلى برتقالية عند دمج قنوات الانبعاث الزائفة ذات اللون الأحمر والأخضر. مجتمعة. توضح هذه المعلومات أن نظام تقسيم انبعاثات الكاميرا المزدوجة لديه الدقة المكانية والزمانية والبصرية اللازمة للكشف عن الميزات الخلوية والجزيئية في تطبيقات مثل فحوصات التصاق غرفة التدفق التي تتحرك فيها الخلايا بسرعة عبر مجال الرؤية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد ومعايرة نظام تقسيم انبعاثات الكاميرا المزدوجة أو تصوير مقايسة التصاق غرفة تدفق اللوحة المتوازية في الوقت الفعلي بلونين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على فحوصات أخرى في المختبر تستخدم التألق لدراسة سلوك الخلية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة إجراءً لإجراء اختبار التصاق غرفة تدفق الألواح المتوازية باستخدام نظام انقسام الانبعاث لكاميرا مزدوجة. يسمح النظام بالتسجيل المتزامن لتسلسلات الصور في الوقت الحقيقي بلونين، مما يعزز جودة تصوير الخلايا الحية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكروسكوب الفلوري
- تصوير الخلايا الحية
- اختبارات التصاق الخلايا
الخلفية
- تحسن أنظمة الكاميرا المزدوجة من قدرات التصوير.
- التصوير في الوقت الحقيقي ضروري لاختبارات الخلايا الحية.
- الدقة الزمنية العالية ضرورية لجمع البيانات بدقة.
- يسمح انقسام الانبعاث بالتصوير الملون المتزامن.
هدف الدراسة
- لإجراء اختبارات التصاق باستخدام تقنيات تصوير متقدمة.
- لإظهار فوائد أنظمة الكاميرا المزدوجة على الإعدادات ذات الكاميرا الواحدة.
- لالتقاط صور ملونة مزدوجة عالية الجودة في الوقت الحقيقي.
الطرق المستخدمة
- مواءمة الكاميرات المزدوجة للتصوير الأمثل.
- تحضير الخلايا والركائز للاختبار.
- معايرة إعدادات الكاميرا للحصول على صورتين بلونين.
- التقاط تسلسلات الصور التي توضح الدقة الزمنية العالية.
النتائج الرئيسية
- الحصول الناجح على صور مزدوجة الألوان.
- تحقيق الدقة الزمنية العالية في تسلسلات الصور.
- يمكن تخصيص أوقات تعريض مختلفة لكل كاميرا.
- الاحتفاظ بالحقل الكامل للرؤية أثناء التصوير.
الاستنتاجات
- تعزز أنظمة الكاميرا المزدوجة جودة التصوير الفلوري.
- التصوير في الوقت الحقيقي ممكن بدقة عالية.
- هذه الطريقة مفيدة لدراسات التصاق الخلايا الحية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Real-time dual-color imaging enables precise tracking of molecular dynamics in live cell adhesion assays, critical for de-risking metastasis and inflammation targets. The dual camera emission splitting system provides high temporal resolution without sacrificing field of view, supporting quantitative analysis of rapidly moving cells. This capability strengthens predictive confidence in early discovery by revealing colocalization patterns of adhesion molecules under physiological flow conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial distribution and colocalization of adhesion molecules like CD24 and HECA452 on circulating tumor cells.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of how molecular localization affects cell rolling, adhesion, and transmigration under flow.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates spatially identical, fluorophore-specific image pairs for accurate multiplexed detection in flow-based assays.
- Operational Value: Allows independent exposure time optimization per channel to minimize bleed-through and maximize signal fidelity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models cancer metastasis mechanisms by perfusing labeled cancer cells over reactive substrates expressing endothelial ligands.
- Operational Value: Maintains full field of view and high temporal resolution to capture rare adhesion events in dynamic systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative, real-time readouts of molecular interactions during cell adhesion, directly informing lead identification decisions.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking of targets by visualizing adhesion molecule dynamics in live cells under shear stress.
- Screening: Delivers standardized, reproducible dual-color outputs suitable for assay automation and compound screening campaigns.
- Analytics: Produces synchronized image sequences with precise temporal alignment for colocalization and motility analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro adhesion findings to in vivo relevance by simulating physiological flow conditions in metastasis models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multi-parametric live cell analysis across oncology, immunology, and cardiovascular projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by directly observing molecular co-distribution on migrating cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through precise camera alignment protocols and digital correction tools.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing visual evidence of target engagement in dynamic, physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of adhesion targets based on functional validation under flow.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and camera alignment using manufacturer calibration grids.
- Needs inverted epi-fluorescence microscope with high-intensity light source, filter cubes, and dual camera emission splitting hardware.
- Depends on imaging software capable of monochrome camera control, image merging, and spatial registration (e.g., StreamPix with SimulPix module).
- Involves standardization of cell preparation, staining protocols, and flow chamber assembly for consistent adhesion measurements.
- Limited by the need for careful bleed-through correction when using spectrally overlapping fluorophores in dual-channel detection.
