التحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد لعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم للاستقطاب في إصابات الدماغ التجريبية

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور التعبير والتوطين الخلوي لعلامات النمط الظاهري للبلاعم الدبقية الصغيرة بعد نقص تروية الدماغ. أولا ، يتم تلطيخ أقسام التبريد من أدمغة الفئران الإقفارية لتحديد علامات تنشيط البلاعم الدبقية الصغيرة. تخضع الأقسام الملطخة لتصوير متحد البؤر ثلاثي الأبعاد.

ثم تتم معالجة الصور الناتجة لإنشاء عروض ثلاثية الأبعاد ، ويتم إجراء تحليل الصور لتوطين التعبير عن العلامات في مجموعات الخلايا. توضح البيانات الناتجة فعالية التحليل متحد البؤر ثلاثي الأبعاد في تعيين تعبير العلامة بشكل صحيح لجسم خلوي معين عندما يتم التعبير عن علامتين بواسطة نفس الخلية ، ولكن في مقصورات فرعية مختلفة ، قد لا يكون التحديد المشترك وحده مفيدا للغاية. يتيح استخدام التحليل ثلاثي الأبعاد ، كما سنوضح هنا ، دقة ودقة أفضل.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتعقيد استجابة الدماغ للإصابة الإقفارية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الحالات الحادة أو المزمنة الأخرى حيث تم اقتراح دور مزدوج للبلاعم الدبقية الصغيرة في الإصابة والإصلاح. أو في تلك الحالات التي تحتاج فيها الإشارات إلى توطين انتقائي في طائرات خاصة مختلفة ، سيأخذك كارلو بيريغو وستيفان من ماجالي خلال الخطوات المختلفة للإجراء. يستخدم البروتوكول التالي أنسجة دماغ الفئران التي تم فيها إحداث نقص التروية عن طريق الانسداد الدائم للشريان الدماغي الأوسط.

استخدم ناظم البرد لجمع الأقسام الإكليلية التسلسلية 20 ميكرون من الدماغ على الجيلاتين. تجلب الشرائح المغطاة جميع الكواشف والعينات إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. يرجى ملاحظة أن التخفيف الوظيفي للأجسام المضادة والمصل المدرج في المستند المصاحب لها ناتج عن التجارب التي تم إجراؤها من أجل الحصول على أفضل أداء عند استخدام الأجسام المضادة والمصل المختلفة.

يجب التحقق من صحة البروتوكول. ابدأ بتدوير الأقسام الموجودة على الشريحة باستخدام قلم مانع السوائل لتقليل كمية الكواشف المطلوبة. بعد ذلك ، ضع أقسام الدماغ في غرفة مبللة باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد.

أضف درجة حرارة الغرفة PBS إلى الأقسام واحتضنه لمدة خمس دقائق لغسلها. ثم باستخدام حقنة واحدة مليلتر يمكن التخلص منها بإبرة ، قم بإزالة المحلول وكرر الغسيل مرة أخرى بعد إزالة الغسيل الثاني ، استمر في تلطيخ العينات باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد وحقنة يمكن التخلص منها لجميع عمليات تبادل المحلول. يجب تنفيذ إجراء التلوين كما هو موجز. هنا.

يرجى الاطلاع على النص المصاحب للحصول على التفاصيل ، بما في ذلك خطوات الغسيل. أولا ، يتم تحضين الخلايا ب 1٪ بيروكسيد الهيدروجين بعد الحظر بمصل الماعز العادي. يتم احتضانها بجسم مضاد أولي ضد CD 11 B.بعد ذلك ، يتم تحضين الشرائح بجسم مضاد ثانوي مناسب متبوعا ب triss أو NACL tween buffer أو TNT ، ثم triss أو H-C-L-N-A-C-L أو المخزن المؤقت للحجب ، أو TNB بعد الحضانة مع TNB.

يتم احتضان الشرائح باستخدام الستربتافيدين HRP متبوعا بمخفف تضخيم يحتوي على السيانيد الخمسة تيروم ، والذي سيضخم إشارة الفلورسنت المناعي. بعد ذلك ، يتم احتضان الشرائح باستخدام NGS لمنع مواقع الربط غير المحددة. ثم يتم احتضانها بجسم مضاد أساسي ضد CD 68.

بعد الحضانة بالجسم المضاد الأساسي ، يتم بعد ذلك تحضين الخلايا في الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلور المناسب ، متبوعا بميكروغرام واحد لكل مليلتر من الخطافات لتسمية الحمض النووي. بمجرد اكتمال التلوين ، قم بتركيب أقسام التبريد باستخدام الذهب المطول عند تركيب الأقسام ، وتجنب توليد فقاعات الهواء. قم بتخزين الأقسام عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى يتم تحليلها.

يجب إجراء الحصول على إشارة الفلورسنت في غضون أسبوع واحد. يستخدم هذا البروتوكول مجهر IX 81 المجهز بوحدة مسح متحد البؤر FV 500 مع ثلاثة خطوط ليزر: الأرجون كريبتون عند 488 نانومتر ، والهيليوم نيون الأحمر عند 646 نانومتر ، والهيليوم نيون الأخضر عند 532 نانومتر ، بالإضافة إلى الصمام الثنائي للأشعة فوق البنفسجية في إنفلونزا برنامج U 500. حدد ليزر الإثارة المناسب والمرايا ثنائية اللون.

قم أيضا بإعداد دقة الصورة بحد أدنى 800 × 600 بكسل. بعد ذلك ، ضع الشريحة على مسرح المجهر وباستخدام مضان epi ، وحدد منطقة الاهتمام ، وقم بزيادة التكبير تدريجيا إلى هدف 40 ×. ثم قم بالتبديل إلى طريقة الفحص المجهري بالمسح الضوئي بالليزر وقم بإجراء عمليات مسح متكررة أثناء ضبط مستوى طاقة مضاعف الضوء والكسب لكل قناة.

سيؤدي ذلك إلى تقليل تداخل الإشارة الناجم عن الإثارة المعاصرة بأطوال موجية مختلفة. حافظ على الكسب منخفضا قدر الإمكان لتجنب الإشارات غير المرغوب فيها. استمر في المسح المتكرر ، اضبط التركيز وحدد الأطراف السفلية والعلوية للمحور Z بطول إجمالي للمحور Z يبلغ 10 ميكرون.

ثم أوقف الفحص المتكرر. بعد ذلك ، أدخل حجم الخطوة. يجب أن يكون أقرب ما يمكن إلى حجم البكسل ، وهو 0.225 ميكرون.

سيعطي هذا نسبة حجم قياسية من واحد إلى واحد على المحور Z في برنامج تنشيط مرشح kalman مرتين على الأقل. خوارزمية كالمان هي وظيفة تكرارية تقضي على الإشارة العشوائية ، مثل فوكسل موجبة مفردة تنتمي إلى ضوضاء الخلفية ، وبالتالي تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. الآن قم بتنشيط وضع المسح المتسلسل لتجنب النزيف من خلال التأثيرات.

انتقل إلى نقطة منتصف المحور Z وقم بإجراء مسح تسلسلي XY. تحقق من إعداد PMT والكسب لضمان نسبة إشارة مرضية إلى الضوضاء. قم بتشغيل الاستحواذ على XY، Z بعد الاستحواذ.

تصدير البيانات كملف TIF متعدد. يحتوي كل ملف TIF متعدد عادة على ثلاث قنوات ملونة و 44 مستوى بؤري للمعالجة. ابدأ بفتح برنامج imas.

أولا ، حدد عرض التجاوز ، ثم قم بتحميل ملف TIF المتعدد. بعد ذلك في لوحة ضبط الشاشة ، حدد اللون المطلوب لكل قناة هنا. يمثل اللون الأحمر CD 11 B.Green يمثل CD 68 ، ويمثل اللون الأزرق بقعة الحمض النووي للخطافات لإزالة الضوضاء من الخلفية ، وزيادة الحد الأدنى للقيمة على لوحة ضبط الشاشة لكل قناة.

ثم انتقل إلى عرض القسم لتصور مستوى بؤري XY واحد مع إسقاطات متعامدة للمحور x و Z و YZ. تحرك على طول المحور Z بحثا عن التحديد المشترك، والذي يظهر على شكل وحدات بكسل صفراء. انقر فوق منطقة صفراء لمعرفة ما إذا كان التحديد المشترك موجودا على طول المحور Z ، مما يشير إلى أنه ينتمي إلى جسم صلب المحور Z.

الإسقاطات في الجزء الأيمن والسفلي من الشكل. التقط لقطة ، ثم ارجع إلى عرض التجاوز. بعد ذلك ، في القائمة المنسدلة تحرير ، حدد اقتصاص 3D وحدد منطقة اهتمام لعزل خلية أو مجموعة من الخلايا.

ثم في لوحة ضبط الشاشة ، حدد قناة واحدة. حدد منشئ خوارزمية الأسطح الفائقة. ثم لإعداد الخوارزمية ، أولا ، حدد قناة.

ثم حدد الحد كنفس الحد الأدنى للقيمة كما هو محدد في لوحة ضبط العرض وحدد تغيير الحجم إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، حدد التنعيم على أنه 0.200. حدد لوحة الألوان وقم بتغيير المظهر حسب الضرورة.

كرر الإعداد لمنشئ خوارزمية الأسطح التجاوزية لكل قناة. ثم في لوحة ضبط الشاشة ، قم بإلغاء تحديد قنوات التألق ، وحدد جميع الأسطح الثلاثة. أخيرا ، حرك وحدة التخزين للعثور على أفضل طريقة عرض والتقط لقطة لتحديد نمط التعبير المشترك لعلامات MM.

تم تنفيذ بروتوكولات التألق المناعي والاكتساب متحد البؤر الموصوفة في هذا الفيديو في نموذج فأر لنقص التروية البؤري الناجم عن الانسداد الدائم للشريان الدماغي الأوسط. يظهر عرض ثنائي الأبعاد للصور المكتسبة أنه بعد 24 ساعة من نقص التروية ، يتم التعبير عن العلامات الليزوزومية CD 68 ، الموضحة باللون الأخضر ، في الضخامية وسط الخلايا الإيجابية CD 11 B ، والتي تظهر باللون الأحمر الموجود في اللب الإقفاري. يوضح إسقاط المحور Z الموضح في أسفل اليمين أن توزيع العلامة الموثق في عرض المستوى الفردي موجود أيضا على طول المحور Z في المنطقة الحدودية.

تعرض الخلايا الإيجابية CD 11 B أجساما خلوية ضخامية مع عمليات إيجابية للغاية ل CD 68 ، مما يشير إلى أن البلعمات مرتبطة بغشاء الخلية. يشير هذا إلى السلوك الحمضي النشط ل PHA للخلايا الدبقية الصغيرة لتقييم التعبير المشترك عن CD 68 و YM واحد ، وهي علامة على M اثنين مستقطبين. مم ، خضعت الصور الفلورية لعرض ثلاثي الأبعاد.

يشير العرض ثلاثي الأبعاد للصور المكتسبة الموضحة هنا إلى وجود خلايا موجبة CD 68 موضحة باللون الأخضر وخلايا YM موجبة واحدة تظهر في فوكسل الفلورسنت الأحمر. بالتوازي ، قد ينتج عن رؤية المراقب إشارة موضعية مشتركة تظهر على أنها صفراء ، والتي قد لا تكون مرتبطة بالمسافة الفعلية بين العلامات. لتعريف الترجمة المشتركة.

يجب إنشاء عرض مستوى واحد مع إسقاطات للمحور Z يتحرك على طول المحور Z. أبحث عن التحديد المشترك. يتم الحصول على إسقاط المحور Z كما هو موضح في الجزء الأيمن والسفلي من هذه الصورة.

يمكن تحويل فوكسل الفلورسنت إلى أجسام صلبة عن طريق عرض ثلاثي الأبعاد مع تخصيص تعبير العلامة لجسم خلوي معين. بعد التكبير العالي والعرض ثلاثي الأبعاد ، يبدو أن العلامتين تنتميان إلى خلايا مختلفة على مقربة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص التألق المناعي باستخدام علامات وأصباغ متعددة ، وكيفية الحصول على صور ثلاثية الأبعاد وتصورها بشكل صحيح عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن تحليل ما بعد المعالجة الموصوف الذي يمكن استغلاله بشكل مثمر لتحليل أي تعبير مشترك أو تحديد موقع مشترك على المستوى الخلوي ، أو في تلك الحالات التي تحتاج فيها الإشارات إلى أن تكون مترجمة بشكل انتقائي في مستويات مكانية مختلفة.