Name: Permeabilization من خلايا منضمون باستخدام غاز خامل جت (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: تعلم تقنية نفث الغاز الخامل لإحداث نفاذية مؤقتة في الخلايا اللاصقة. تُستخدم هذه الطريقة لنقل المواد الوراثية والجزيئات الحيوية بكفاءة عالية إلى الخلايا الثديية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر مصادر التمويل التالية: كندية معاهد للأبحاث الصحية (CIHR)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC).

1. تطوير برنامج ابفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وترد تحكم تدفق الشامل (MKS M100B قداس فلو المراقب المالي) إلى خط غاز الهيليوم لضمان معدل تدفق الغاز دقيقة. يتم التحكم من قبل هذه الوحدة مدخلا الجهد، والتي تتراوح بين 0 و 5 V. حلقة التحكم في البرنامج ابفيف يحدد الجهد المطلوب في أي وقت من الأوقات. التواصل بين الكمبيوتر ويتم تنفيذ وحدة تحكم تدفق الشامل من قبل الجهاز الحصول على البيانات (USB-NI 6009)، ويوفر 12 فولت التيار الكهربائي السلطة للتحكم تدفق الشامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم شريحتين المواقع الخطية للسيطرة على الحركة من لوحة 6 جيدا، واحدة لكل اتجاه. ويتكون كل مجلس من MA15 سلسلة Velmex الجمعية Unislide إلى جانب وجود محرك خطوة، ويتم التحكم في كل من المجالس التي كتبها واحد Velmex VXM يخطو المراقب للسيارات. وحدة تحكم يسمح للركض من كل دليل أو محرك يقبل سلسلة من الأوامر المسلسل الخارجية، ومزيج من التي تسمح لحركة معينة عatterns. عدة أنماط يمكن برمجتها في برنامج ابفيف، مما يتطلب من المستخدم سوى تقديم سرعة الشعلة المطلوب فضلا عن أبعاد المسار. </li></ol> 2. إعداد معدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح كل من اسطوانة الهليوم ومنظم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل وحدة تحكم المحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج ابفيف والتحقق من جميع الشروط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد يتركز المنصة. للتحقق، والنظر في كل مرحلة الحركية والتحقق من أن كل حرف ليس بالقرب إما نهاية المرحلة. إما لديها مركز البرامج العربات أو ضبط باستخدام عناصر التحكم الركض على الجزء الأمامي من وحدة تحكم المحرك يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت هذه هي الجولة الأولى من النهار، فمن المستحسن لتشغيل البرنامج مرة واحدة دون الخلايا، لضمان يعمل الإعداد بشكل صحيح. </li></ol> 3. إعداد جيت الغاز شعرية فوهة الارتفاع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعرية من صاحب الصفر والاتصال الهاتفي الارتفاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 6 جيدا لوحة سن المنصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وتخفيض الشعرية طائرة الغاز إلى قاع البئر حتى يضرب انزلاق الغطاء. تأمين الشعرية في حامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الاتصال الهاتفي الارتفاع، رفع شعري 3 مم. بمناسبة هذا الارتفاع على قاعدة الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الشعرية إلى ارتفاع آمنة ثم قم بإزالة لوحة 6 جيدا. </li></ol> 4. خلية بروتوكول Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خط الخلية تمسكا نقطة التقاء على غطاء زجاجي ينزلق في لوحة 6 جيدا باستخدام تقنيات زراعة القياسية. لخلايا هيلا، البذور 6 لوحات جيدة مع 2 × 10 5 خلايا لكل بئر واحتضان لمدة 48 ساعة قبل العلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حجم مناسب من محلول يحتوي على ناقلات المطلوب. لhrGFPII-1، تركيز 50 نانوغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X توفر إشارة قوية الفلورسنت في خلايا هيلا 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. للدراسات ديكستران، فمن المستحسن 80 ميكروغرام / مل من 10 كيلو دالتون ديكستران الفلورية الخضراء. من الآن فصاعدا، سوف يحال هذا الحل لو &quot;حل ناقلات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا سائل الإعلام والثقافة من بئر وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ميكرولتر من الحل 1،370 ناقلات أعدت في الخطوة 4.2 في أيضا. هذا ينبغي أن يؤدي إلى عمق السائل من حوالي 1.3 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البئر تحتوي على حل ناقلات في وسط المنصة. خفض فوهة طائرة الغاز إلى مستوى ملحوظ من قبل مما يدل على ارتفاع فوهة 3 مم فوق الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط معدل تدفق الهليوم في برنامج ابفيف وتحديد نمط الحركة المطلوبة لاستخدامها. حدد &quot;تشغيل&quot; عندما تصبح جاهزة لبدء بروتوكول permeabilization. وسوف تكون هناك فترة تأخر الأولية خلالها تحكم تدفق الشامل تستعد لتوفير معدل تدفق اللازمة. مرة واحدة تم الوصول إلى معدل التدفق المناسبة، سيقوم البرنامج ابفيف تفعيل المحركات السائر لتحريك جيدا في نمط permeabilization المطلوب. بمجرد أن توقفت منصة، انتظر حوالي 30 ثانية وإزالة الحل النواقل.ملاحظة: يحدث permeabilization الأمثل قرب الضغط الديناميكي من 100 إلى 200 باسكال عند مخرج الفوهة، وهذا يتوقف على قطر الشعيرات الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء بشكل جيد مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،3-4،6 عن العدد المرغوب فيه من التجارب. ملاحظة: تأكد من تضمين عينات السيطرة التي تتكون من الآبار التي يجري شغلها مع الحل ناقلات الغاز دون طائرة يتم تشغيلها عليها. ترك الحل في آبار المراقبة لحوالي 1 دقيقة ثم الشروع في خطوات 4.5 و 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تشغيل تجربة ترنسفكأيشن hrGFP، والعودة لوحة 6 جيدا إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة للسماح للمواد transfected أن كتب من قبل الخلايا. إذا تشغيل التجربة permeabilization ديكستران، والعودة لوحة 6 جيدا إلى الحاضنة لمدة 15 دقيقة. </li></ol> 5. خلية التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، وعلى الفور قبل التصوير، ومباين مع وصمة عار العيش / قتيلا المناسبة لتقييم موت الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا صورة مع appropالمجهر riate للتحقيق فعالية ترنسفكأيشن / permeabilization. </li></ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li>
<li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+gene+transfer+%28electroporation%29+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+analysis+techniques%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li>
<li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li>
<li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li>
<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

خاملة permeabilization طائرة الغاز هو تقنية مفيدة لترنسفكأيشن الخلية ملتصقة. لأنها توفر القدرة على نقل الجزيئات الحيوية في الخلايا مع استخدام القوات الميكانيكية، مما يلغي الحاجة إلى المواد الكيميائية الضارة المحتملة أو ناقلات فيروسية. تقنية يحتمل أن تعطي الباحثين والأطباء وسيلة فعالة وبسيطة نسبيا لبالنقل على وجه التحديد الخلايا. الانتقائية من permeabilization هو أيضا فريدة من نوعها تسمح للباحثين لعلاج خلايا معينة فقط في مستعمرة واحدة والتي يمكن أن تكون مفيدة في تطبيقات متعددة. </p...

مع تطور الطب الحيوي وفهم الميكانيكا الخلية، وأصبح تسليم الجزيئات الحيوية في الخلايا الحيوية لكثير من مجالات البحث والعلاجات الطبية. وقد تم تطوير تقنيات مختلفة لإدخال جزيئات الأجنبية من خلال غشاء البلازما والخلايا في العصارة الخلوية. هذه يمكن أن تصنف عموما إما: تقنيات الفيروسية أو الكيميائية أو الميكانيكية. يمكن أن تقنيات الفيروسية بالنقل المواد الجينية مثل الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام ناقلات فيروسية 1. تقنيات الفيروسية تميل إلى أن تكون الكفاءة عالية في خطوط الخلايا معينة، ولكن لديهم القدرة على التفاعلات المناعية والتهابات 2. وتشمل أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية المشترك مع هطول فوسفات الكالسيوم 3، 4 والسموم الناتجة عن بعض بكتيريا lipofection 5. وقد أثبتت هذه التقنيات لتكون فعالة، ومع ذلك، تنشأ مشاكل معينة مثل السمية الخلوية وغير النوعية. علاوة على ذلك، تقنيات مثل الفوسفاط الكالسيومتم العثور على البريد هطول أن يكون الكفاءة ترنسفكأيشن تصل إلى 70٪ ولكن فقط في خطوط الخلايا معينة، ونادرا ما في الخلايا الأولية 6. هذا هو من المذكرة كما يتم وضع زيادة الجهود البحثية في الخلايا الأولية، وخاصة في حالة تصميم العلاجات المختلفة للاستخدام السريري ودراسة سير الحمض النووي. تعطل الزمني للغشاء الخلية من خلال المحفزات الميكانيكية هو بديل لإدخال جزيئات الأجنبية إلى الخلايا. وتشمل التقنيات: Microinjection من جزيئات 7، التثقيب الكهربائي باستخدام مجال كهربائي لتعطيل الغشاء 8،9، باستخدام الموجات فوق الصوتية sonoporation لتعطيل غشاء الخلية 10-12، الجسيمات القصف كما يدل على ذلك &quot;مدفع الجينات&quot;، الذي يطلق النار على جزيئات ملزمة مع الجينات في الخلية 13، ومؤخرا، وتطبيق إجهاد القص السوائل التي قد تظهر لpermeabilize زمنيا خلايا الثدييات 14،15. على الرغم من ميكانيكيطرق آل تجنب بعض القضايا المذكورة آنفا، وعادة ما تصاحبها الكفاءة أقل والاجهزة المعقدة جدا والمتخصصة. وقد وضعت الشعلة توهج التفريغ الضغط الجوي (APGD تي) في ماكغيل مع الهدف الأولي من functionalizing الأسطح وفصل الخلايا الملتصقة في المختبر 16. مصادفة، تم اكتشاف أن وصمة العيش / قتيلا تستخدم على نحو ما كان يجري اتخاذها في الخلايا من دون وكيل permeabilizing إضافتها. وعلاوة على ذلك، وهذا يبدو أنه لم يحدث إلا في مناطق محدودة من الآبار التي حدثت لمتابعة المباراة مع مسار الشعلة. واصلت التحقيق في قدرات permeabilization من APGD-t و في دراسات المراقبة، تبين أن الطائرة غاز خامل الناقل من البلازما دون الإثارة كانت أيضا قادرة على permeabilize الخلايا. هذا يتناقض مع الفرضية الأولية أن رد الفعل الأنواع التي أوجدتها البلازما النفاثة ضعف وظيفة الغشاء مؤقتا واقترح ببساطة المطاط ووكانت قوات كال كافية للتسبب permeabilization الخلية. من هنا، واصلت الدراسات في المختبر في محاولة لتحديد وتوصيف كفاءة permeabilization من طائرة غاز خامل وكذلك نظرة على قدرات ترنسفكأيشن في 16. من خلال هذه الدراسات، فقد وجد أن micropores القيام به في شكل الواقع في غشاء البلازما، وهذه المسام تميل إلى ختم غضون ما يقرب من 5 ثانية 15. لقد أثبتنا فائدة هذه التقنية في المختبر والمجراة في غشاء مشيمائي من جنين الفرخ.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>بروتين الفلورسنت الأخضر لتجارب التعدي على خلايا HeLa</td></tr><tr><td>Dextran، AlexaFluor 488; 10,000 ميجاوات، Anionic، Fixable</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>ديكستران لتجارب النفاذية</td></tr><tr><td>LIVE / DEAD Viability / Cellular Toxicity Kit</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>لمواجهة تلطيخ خلايا</td></tr> الثدييات <tr><td>إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>لتركيب الشرائح عند تصوير</td></tr><tr><td>Ultra High Purity Helium</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>معالي 5.0UH-T</td> <td>& nbsp;</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM / High Glucose Media - 500 مل</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>لخلايا HeLa</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>26140079 لوسائط DMEM</td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين ، سائل</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>لوسائط DMEM</td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>تم إنتاجه في المختبر</td></tr> <tr><td>&nbsp ؛</td><td></td><td></td><td><قوي>الجدول 1</قوي>. قائمة الكواشف المطلوبة</td></tr><tr><td>6-Well Clear TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3506</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td># 1 22 × 22 أغطية</td><td>فيشر</td><td>12-542B</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>الشعيرات الدموية</td><td>العالمية للأدوات الدقيقة WPI</td><td></td> معرف <td>معلومات التحجيم</td></tr><tr><td>(مم): 1 ، 0.86 ، 0.68 ، 0.5 طلب #: 1B200 ، 1B150 ، 1B120 ، 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass-Flo Controller</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>وحدة تحكم التدفق الشامل ، سلسلة M100B ، تتطلب مصدر طاقة خارجي بجهد 12 فولت</td></tr><tr><td>USB-6009 DAQ</td><td>Device National Instruments</td><td>779026-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>مجموعة UniSlide مع محرك متدرج ووحدة تحكم</td><td>Velmex</td><td></td><td>Two series MA15 UniSlide Assemblies ، مزودة بمحركات متدرجة Vexta 1.8 & deg مقدمة من Velmex ، ويتم التحكم فيها بواسطة وحدة تحكم محرك متدرجة VXM</td></tr> <tr><td>&nbsp ؛</td><td></td><td></td><td><قوي>الجدول 2.</قوي> قائمة المعدات المطلوبة</td></tr></tbody></table>

permeabilization من خلايا منضمون باستخدام غاز خامل جت

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

توجد تقنيات مختلفة ترنسفكأيشن الخلية وهذه يمكن تقسيمها إلى ثلاث فئات عريضة: الفيروسية والكيميائية والميكانيكية. يصف هذا البروتوكول وسيلة ميكانيكية لpermeabilize زمنيا الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل التي يمكن أن تسهل نقل الجزيئات عادة غير قابلة للاختراق في الخلايا. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب يعمل عن طريق نقل قوى القص على غشاء البلازما من الخلايا الملتصقة، مما أدى إلى تشكيل مؤقت لmicropores. مرة واحدة يتم إنشاء هذه المسام، والخلايا هي قابلة للاختراق ثم إلى المادة الوراثية والجزيئات الحيوية الأخرى. القوات الميكانيكية المعنية لا تتعرض لخطر الخلايا الضارة بشكل دائم أو فصل من الركيزة الخاصة بهم. هناك، بالتالي، على نطاق ضيق من ديناميات غاز خامل حيث الأسلوب هو فعالة. وقد ثبت طائرة غاز خامل كفاءة في permeabilizing مختلف خطوط الخلايا الملتصقة بما في ذلك هيلا، HEK293 والخلايا البطانية الأبهر البطني الإنسان. هذا البروتوكول هو مناسبة لعermeabilization من الخلايا الملتصقة على حد سواء في المختبر، وكما أثبتنا، في الجسم الحي، والتي تبين أنها يمكن أن تستخدم لأغراض البحث ويحتمل أن تكون في التطبيقات السريرية في المستقبل. كما أن لديها ميزة permeabilizing الخلايا بطريقة تقييدية مكانيا، والتي يمكن أن تكون أداة بحث قيمة.

ويرد Permeabilization من خلايا هيلا مع 10 كيلو دالتون ديكستران الفلورية الخضراء باستخدام طائرة غاز الهيليوم مع 0.86 مم القطر الداخلي الشعرية في الشكل 1. تم counterstained الخلايا مباشرة بعد permeabilization مع 2 ميكرولتر / مل EthD-1 الحل (لايف / الميت الجدوى / السمسة كيت) لتصور موت الخلية. مباشرة بعد counterstaining، وقد شنت زلات الغطاء وتصويرها. ويبين هذا الرقم نتائج تشغيل طائرة غاز الهيليوم في ثلاثة الضغوط منفذ مختلفة مقارنة مع عينة السيطرة. لاحظ أن عرض المسار p...

يصف هذا البروتوكول وسيلة لpermeabilization مؤقتة من الخلايا الملتصقة باستخدام طائرة غاز خامل. هذه التقنية تسهل نقل المادة الوراثية والجزيئات الحيوية في خلايا الثدييات ملتصقة بها استخدام القوات الميكانيكية لتعطيل غشاء البلازما.

Permeabilization من خلايا منضمون باستخدام غاز خامل جت

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو نفاذ الخلايا الملتصقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع الخلايا التجريبية على شرائح تغطية في أطباق ذات ستة آبار. وتتمثل الخطوة الثانية في شطف الخلايا باستخدام 1XPBS وتغطيتها بالمحلول الذي يحتوي على الجزيء الحيوي المراد نقله إلى داخل الخلية.بعد ذلك، يتم تمرير نفث الغاز الخامل. يتم جعل الخلايا نفاذة للعينة. والخطوة النهائية هي تثبيت الخلايا وصبغها إذا رغبت في ذلك.في النهاية، يُستخدم مجهر التألق المناعي لإظهار كفاءة النفاذ وحيوية الخلايا. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التكاثر أو مسدسات الجينات، في سهولة إعدادها وسماحها بنفاذ مقيد مكانيًا للخلايا الملتصقة. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه التقنية بعض الصعوبات في المزرعة الخلوية، لأن إتقان بعض المعايير قد يستغرق وقتًا، مثل معدل تدفق الغاز أو قطر الشعيرة، لضمان تحقيق نفاذ فعال في تطبيقاتهم المحددة.يتطلب متحكم تدفق الكتلة المستخدم في هذا الإجراء مصدر طاقة خارجي بجهد 12 vol، وهو متصل بخط غاز الهيليوم لضمان معدل تدفق دقيق للغاز، ويتم الربط بين متحكم تدفق الكتلة والكمبيوتر بواسطة جهاز الحصول على البيانات. يتم التحكم في هذه الوحدة عن طريق جهد دخل يتراوح بين صفر وخمسة فولتات. وتحدد حلقة تحكم في برنامج LabVIEW الجهد المطلوب في أي وقت معين.تُستخدم منزلقات خطية لتحديد الموضع للتحكم في حركة طبق الستة آبار، بواقع منزلقة واحدة لكل اتجاه. وتتكون كل مجموعة من منزلقة Velm X uni من سلسلة MA 15 متصلة بمحرك خطوي، ويتم التحكم في كلتا المجموعتين بواسطة وحدة تحكم واحدة في المحرك الخطوي من طراز VELM XVXM. تتيح وحدة التحكم إمكانية تحريك كل محرك يدويًا أو استقبال سلسلة من الأوامر التسلسلية الخارجية.مما يتيح أنماط حركة محددة. يمكن برمجة عدة أنماط في برنامج LabVIEW، بحيث يطلب من المستخدم فقط تحديد سرعة الشعلة المطلوبة بالإضافة إلى أبعاد المسار. ابدأ في تجهيز المعدات عن طريق فتح كل من أسطوانة الهيليوم والمنظم، ثم قم بتشغيل وحدة التحكم في المحرك.افتح برنامج عرض المختبر وتحقق من جميع الظروف. بعد ذلك، تأكد من أن المنصة متمركزة للفحص. افحص كل مرحلة من مراحل المحرك وتحقق من أن كل عربة ليست بالقرب من أي من طرفي المرحلة، ثم اطلب من البرنامج تمركز العربات.إذا كانت هذه هي المرة الأولى في اليوم، يوصى بتشغيل البرنامج مرة واحدة بدون خلايا للتأكد من أن الإعداد يعمل بشكل صحيح. لتحضير ارتفاع فوهة شعيرية gas Jett، قم بإزالة الشعيرية من الحامل وصفر قرص ضبط الارتفاع. ضع الصفيحة ذات الستة آبار على المنصة.استبدل الشعيرية الخاصة بنفاث الغاز واخفضها إلى قاع البئر حتى تلامس شريحة الغطاء. ثبت الشعيرية في الحامل باستخدام قرص ضبط الارتفاع. ارفع الشعيرية بمقدار 3 mm، ثم حدد هذا الارتفاع على قاعدة الشعيرية.وأخيرًا، ارفع الأنبوب الشعري إلى ارتفاع آمن ثم أخرج الصفيحة ذات الستة آبار. يجب زراعة الخط الخلوي الملتصق لهذا البروتوكول حتى الوصول إلى مرحلة الالتحام على شرائح زجاجية غطائية في صفيحة ذات ستة آبار باستخدام تقنيات الزراعة القياسية لخلايا helo. ازرع الصفائح ذات الستة آبار بكثافة 2×10⁵ خلية لكل بئر واتركها في الحاضنة لمدة 48 ساعة قبل المعالجة.في يوم العلاج، قم بتحضير حجم مناسب من المحلول الذي يحتوي على الناقل المطلوب. بالنسبة لدراسات الديكسترين، يُوصى باستخدام 80 micrograms per milliliter من الديكسترين الفلوري الأخضر بوزن 10 kilodalton، ومن هنا فصاعداً، سيُشار إلى هذا المحلول باسم محلول الناقل.أزل وسط زراعة الخلايا من البئر واشطفه ثلاث مرات باستخدام XPBS، ثم ضع 370 microliters من محلول الناقل في البئر باستخدام ماصة. يجب أن يؤدي ذلك إلى عمق سائل يبلغ حوالي 1.3 millimeters. ضع البئر الذي يحتوي على محلول الناقل في مركز المنصة.اخفض فوهة نفث الغاز إلى المستوى المحدد مسبقاً والذي يشير إلى أن ارتفاع الفوهة يبلغ ثلاثة مليمترات فوق الشريحة. اضبط معدل تدفق الهيليوم في برنامج lab view واختر نمط الحركة المطلوب استخدامه. ثم اختر التشغيل (run).عند الاستعداد لبدء بروتوكول النفاذية، ستكون هناك فترة تأخير أولية يقوم خلالها متحكم تدفق الكتلة بالتحضير لتوفير معدل التدفق اللازم. ولضمان نجاح هذا البروتوكول، من المهم تحسين ظروف التدفق لتقليل عمق الخلية وانفصال الخلايا. وبمجرد الوصول إلى معدل التدفق المناسب، سيقوم برنامج lab view بتنشيط المحركات الخطوية لتحريك البئر وفق نمط النفاذية المطلوب. وعندما تتوقف المنصة، قم بإزالة طبق الستة آبار من المنصة.انتظر لمدة 30 ثانية تقريباً، ثم قم بإزالة محلول الناقل. اغسل البئر ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد الغسلة الثالثة، املأ البئر بوسط زراعي جديد.كرر بروتوكول النفاذية للعدد المطلوب من التجارب. تأكد من تضمين عينات ضابطة تتكون من آبار يتم ملؤها بمحلول الناقل دون تشغيل نفث الغاز فوقها. اترك المحلول في الآبار الضابطة لمدة دقيقة واحدة تقريباً قبل إزالة المحلول.غسل الخلايا بمحلول PBS وملء الفجوة بوسط استزراع جديد. يتم إرجاع الطبق ذو الفجوات الست إلى الحاضنة، وفي حالة نفاذية الديكسترين، يتم التحضين لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، يتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر المناسب لفحص كفاءة النفاذية.تظهر هنا نتائج نفاذية خلايا HeLa باستخدام ديكسترين فلوروسنت أخضر بوزن 10 kilodalton باستخدام نفث غاز الهيليوم بقطر داخلي 0.86 millimeter. تظهر اللوحات الشعيرية A وB وC نتائج تشغيل نفث غاز الهيليوم عند ثلاثة ضغوط مخرج مختلفة، واللوحة D هي مجموعة ضابطة أضيف إليها الديكسترين ولكن دون تعريضها لنفث غاز الهيليوم. تم صبغ الخلايا تباينياً مباشرة بعد عملية النفاذية لتصور موت الخلايا. في هذه الصور، يفلور الديكسترين باللون الأخضر وتفلور الخلايا الميتة باللون الأحمر.لُوحظ في اللوحين A وB أن عرض مسار النفاذية وكفاءتها قد ازدادا مع زيادة الضغط الديناميكي، مع زيادة طفيفة فقط في موت الخلايا. ومع ذلك، بمجرد الوصول إلى ضغط ديناميكي مرتفع كما لوحظ في اللوح c، جُردت خلايا heela من الشرائح الغطائية وحدث نفاذ محيطي ضئيل جداً وفقاً لدراسات المجهر الإلكتروني الماسح. كما لُوحظ وجود مسام دقيقة في غشاء الخلية.في هذا المثال، تم إجراء عملية النفاذية لخلايا heela باستخدام نفثة من غاز الهيليوم مع شعيرة بقطر داخلي يبلغ 0.86 millimeter عند ضغط مخرج قدره 300 Pascals، وتم الحصول على صور بالمجهر الإلكتروني الماسح بتكبير 50,000 x. يظهر اللوح A عينة ضابطة تبدي سطحاً خلوياً أملس، بينما يظهر اللوح B سطح خلية منفوذة تبدي مساماً بقطر 84 nanometer. بمجرد إتقان هذه التقنية، يجب أن تستغرق من 15 إلى 30 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد اتباع الإجراء، يمكن إجراء عمليات الصبغ لتقييم عوامل إضافية مثل حيوية الخلايا.

permeabilization-of-adhered-cells-using-an-inert-gas-jet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

يصف هذا البروتوكول ميكروفلويديك شارك في ثقافة نموذج للثقافة في وقت واحد ومترجم من الخلايا الظهارية والبكتيريا. ويمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في دور الاشارات الجزيئية للذوبان في مختلف المرضية فضلا عن الشاشة فعالية من السلالات البكتيرية بروبيوتيك المفترضة.

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

وصفا للأساليب المستخدمة لتحويل منضدية HP 500 الطابعة إلى bioprinter. الطابعة غير قادرة على معالجة الخلايا الحية، والذي يسبب مسام عابرة في غشاء. ويمكن استخدام هذه المسام لدمج الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك فلوري G-الأكتين، إلى خلايا المطبوعة.

خلق عابر المسامات غشاء الخلية باستخدام طابعة نافثة للحبر القياسية

الجمع بين monodisperse جيل قطرة مع ترتيب بالقصور الذاتي من الخلايا والجزيئات، ونحن تصف طريقة لتغليف العدد المطلوب من الخلايا أو الجزيئات في قطرة واحدة في معدلات كيلوهرتز. علينا أن نبرهن الكفاءات يتجاوز ضعف تلك التي التغليف غير مرتبة لقطرات واحد ومزدوجة الجسيمات.

ارتفاع الإنتاجية وحيدة الخلية ومتعددة الخلية الصغيرة التغليف

وقد استخدمنا بلازما تعزيز ترسيب الأبخرة الكيميائية لإيداع الأغشية الرقيقة التي تتراوح بين بضعة نانومتر إلى 100 نانومتر عدة في نانو الحجم الجسيمات من المواد المختلفة. نحن في وقت لاحق حفر المواد الأساسية لإنتاج nanoshells أجوف الذي نفاذية تسيطر عليها سمك قذيفة. نحن نصنف نفاذية هذه الطلاءات إلى المواد المذابة الصغيرة وتثبت أن هذه الحواجز يمكن أن توفر إطلاق المطرد للمواد الأساسية على مدى عدة أيام.

التغليف والنفاذية خصائص الجسيمات مبلمر البلازما الجوف

النفث ميكروفلويديك ضد واجهة قطرات الدهون طبقة ثنائية يوفر وسيلة موثوقة لتوليد الحويصلات مع السيطرة على التماثل الغشاء، إدراج البروتينات عبر الغشاء، والتغليف من المواد. هذه التقنية يمكن تطبيقها على دراسة مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية حيث يتم المطلوب الجزيئات الحيوية مجزأة.

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

التصاق الخلايا هو المفتاح للعديد من الأساليب في أبحاث المواد الحيوية وهندسة الأنسجة. يتم تقديم تقنية خطوة بخطوة باستخدام الكيمياء الرطبة لتعديل سطح البوليمر المهم PTFE مع الببتيدات.

الرطب الكيمياء والببتيد الشلل على تترافلوروإيثيلين لتحسين خلية التصاق

&lt; p class = 'jove_content'&gt; تم تصنيع رقاقة مائع دقيقة لإنتاج أزواج من النقاط الذهبية لتوليد الفقاعات الترادفية والجزر المطلية بالألياف الفيبرونكتين لتزيين الخلية المفردة في مكان قريب. تميز مجال التدفق الناتج بقياس سرعة صورة الجسيمات وتم استخدامه لدراسة التأثيرات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك ثقب غشاء الخلية ، وتشوه الغشاء ، واستجابة الكالسيوم داخل الخلايا.

نظام ميكروفلويديك مع الزخرفة السطحية للتحقيق فقاعة التجويف (ق) التفاعل -Cell وBioeffects الناتجة على مستوى وحيدة الخلية

يصف هذا التقرير تقنية بسيطة وسهلة الأداء ، باستخدام فراغ الضغط المنخفض ، لملء قنوات الموائع الدقيقة بالخلايا والركائز للبحث البيولوجي.

منهج تنوعا من الزخرفة البروتينات والخلايا

نماذج الثقافة بلير الحالية لا تسمح للدراسات الفنية في المختبر التي تحاكي في فيفو ميكرونفيرونمينتس. استخدام البولي إثيلين غليكول وأسلوب قولبة أكسيد الزنك، يصف هذا البروتوكول وضع الغشاء المحاكاة البيولوجية سامسونج مع تصلب الانضباطي، المسامية، وتكوين البيوكيميائية الذي يحاكي عن كثب في فيفو مصفوفات خارج الخلية.

سامسونج بوراتيد مطاطا الهلاميات المائية كغشاء الطابق السفلي المحاكاة البيولوجية لثنائي خلية ثقافة

يتم الإبلاغ عن استخدام الهيدروجيلات القابلة للتحلل الضوئي لعزل الخلايا البكتيرية باستخدام أداة عالية الدقة للتربيت الخفيف. يتم مراجعة الإجراءات التجريبية الأساسية والنتائج ومزايا العملية. وتتيح هذه الطريقة العزل السريع وغير المكلف للبكتيريا المستهدفة التي تظهر وظائف نادرة أو فريدة من نوعها من المجتمعات أو السكان غير المتجانسين.

واجهات هيدروجيل قابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا واختيارها وعزلها

نحن نقدم طريقة لحقن الخلايا عبر تقنية Waterjet الخالية من الإبر إلى جانب تكملة من تحقيقات ما بعد الولادة من حيث الجدوى الخلوية والانتشار وقياسات المرونة.

حقن خلايا السدى المشتقة من الأنسجة الدهنية من لحم الخنزير عن طريق تقنية Waterjet

تعلم تقنية نفث الغاز الخامل لإحداث نفاذية مؤقتة في الخلايا اللاصقة. تُستخدم هذه الطريقة لنقل المواد الوراثية والجزيئات الحيوية بكفاءة عالية إلى الخلايا الثديية.

Permeabilization من خلايا منضمون باستخدام غاز خامل جت

استكشف المزيد من الفيديوهات