عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الكبدية البشرية باستخدام عملية تروية بالكولاجيناز تتكون من خطوتين. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قسطرة الأوعية الدموية في قطعة من الكبد باستخدام قسطرة الري، ويلي ذلك تروية قطعة الكبد وهضمها باستخدام الكولاجيناز.

تتمثل الخطوة الثالثة في إزالة محفظة جليسون، مما يؤدي إلى تحرير خلايا الكبد المتفككة. أما الخطوة النهائية فهي عملية طرد مركزي بسرعة منخفضة لعزل الخلايا الكبدية. وفي النهاية، يمكن تحديد الخلايا الكبدية باستخدام مجهر تباين الأطوار أو عن طريق صبغ الألبومين باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية، مع تحديد حيوية وإنتاجية الخلايا الكبدية باستخدام مقايسة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم خطوات القسطرة والهضم. ويرجع ذلك إلى أن القسطرة تتطلب دقة ومهارة معينة، كما أن تحديد اكتمال عملية الهضم قد يكون صعباً. وبالنسبة للأشخاص الجدد في هذه التقنية، ستقوم ناتالي لون، وهي فنية من مختبري، بتوضيح الإجراء.

في هذا العرض التوضيحي، سنستخدم قطعة من كبد الحمل بدلاً من قطعة من كبد بشري. قم بتجهيز معدات تروية قطعة الكبد كما يلي، واضبط الحمام المائي على درجة حرارة مناسبة بحيث تصل المحاليل إلى قطعة الكبد وهي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. وتعد درجة حرارة 41 درجة مئوية مناسبة للمحاليل واحد واثنين وثلاثة، أما بالنسبة للمكثف الزجاجي ذي الغلاف، فيجب أن يكون المحلول أربعة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لتقليل فقدان نشاط الكولاجيناز. وقبل البدء في عملية التروية بوقت قصير، قم بتشغيل منظم الغاز لجهاز الأكسجة. احصل من اختصاصي علم الأمراض على قطعة كبد تكون فيها المحفظة الغليسونية سليمة كلياً أو في معظمها، وبسطح مقطوع واحد فقط.

بينما توضع قطعة الكبد هذه على قمع بوخنر الذي يحتوي على قرص ترشيح مثقب، يجب الآن تحضير نظام التروية باستخدام المحلول الأول بمعدل تدفق منخفض؛ أدخل كانيولا ري منحنية ذات أطراف زيتونية في الأوعية الدموية الكبيرة الموجودة على السطح المقطوع من قطعة الكبد. ومع غسل الدم من الكبد، يصبح النسيج أكثر فاتح اللون في المناطق ذات التروية الجيدة. ويختلف عدد الكانيولات المستخدمة باختلاف أحجام أكباد.

بشكل عام، يجب استخدام من أربع إلى ثمانِ قنيات للكبد الذي يتراوح وزنه من أقل من 20 grams إلى أكثر من 80 grams. اختر مقاس القنية لضمان ملاءمة محكمة وآمنة. اترك الأوعية الدموية الصغيرة مفتوحة ليتم تصريف المحلول المنظم من النسيج.

الآن، قم بزيادة معدل التدفق في المضخة 연動ية (peristaltic pump) ليكون بين 110 إلى 460 milliliters per minute. يُعتبر التروية جيداً إذا أصبح لون قطعة الكبد أفتح طوال فترة معدل التدفق المستخدم. ويعتمد ذلك على حجم الكبد، حيث تُستخدم معدلات تروية أعلى للكبد الأكبر حجماً.

بشكل عام، يُعد متوسط سرعة تروية يبلغ 44 milliliters per minute لكل كانيولا مثاليًا عبر مجموعة مختلفة من أوزان الكبد. يجب أن يؤدي معدل التدفق المختار إلى انتفاخ طفيف في قطعة الكبد. حافظ على رطوبة قطعة الكبد أثناء التروية عن طريق تغطيتها بقطعة من الشاش المبلل بالمحلول الملحي.

بعد تروية النسيج بلتر واحد من المحلول 1 لغسل أي بقايا دم في قطعة الكبد، يتم تغيير سائل التروية إلى المحلول 2 والتروية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، يتم تحويل سائل التروية إلى المحلول 3 والتروية بنصف لتر.

قم الآن بتغيير سائل التروية إلى المحلول الرابع الذي يحتوي على الكولاجيناز. أجْرِ عملية التروية هذه بطريقة تدويرية لمدة تتراوح بين 9 إلى 12 دقيقة أو حتى يتم هضم الكبد بشكل كافٍ. يجب أن تظهر أنسجة الكبد وهي تتفكك قليلاً تحت المحفظة اللامعة.

يجب أن يشعر الباحث أيضاً بأن الكبد أصبح ليناً عند فحصه بالجانب غير الحاد للمشرط. ومن المهم هضم قطعة الكبد للمدة الزمنية الصحيحة، حيث إن الهضم المفرط يمكن أن يؤدي إلى انخفاض حيوية الخلايا الكبدية، بينما قد يؤدي نقص الهضم إلى انخفاض إنتاجية الخلايا الكبدية. ابدأ بإيقاف تشغيل المضخة التمعجية وإزالة الكانيولا من قطعة الكبد.

ثم ضع النسيج في وعاء تبلور يحتوي على 100 إلى 200 milliliters من المحلول. خامسًا. قم بإزالة كبسولة glistens بعناية ورج الخلايا بلطف. إذا كانت هناك مناطق غير مروية بشكل جيد، يمكن استخدام المشرط للقطع عبر هذه المناطق لتحرير الخلايا الموجودة بداخلها.

أضف المزيد من المحلول خمسة حسب الحاجة أثناء العملية، وصولاً إلى جعل الحجم النهائي للمحلول خمسة 500 milliliters. الآن قم بترشيح معلق الخلايا مرتين؛ أولاً، رشح الخلايا عبر مصفاة نايلون بمسامية 210 micron في دورق مخروطي سعة لتر واحد.

بعد ذلك، قم بترشيح الخلايا عبر مصفاة نايلون بمسامية 70 micron في دورق مخروطي سعة لتر واحد. صب حجمين متساويين من معلق الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 200 milliliter. ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي لمعلق الخلايا المُرشح عند 72 Gs لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

قم بشفط السائل وأعد تعليق كتلة الخلايا بلطف في حوالي 200 milliliters من المحلول. خمسة. كرر عملية الطرد المركزي وإعادة التعليق ثلاث مرات، وبعد عملية الطرد المركزي الأخيرة، أعد تعليق الخلايا في محلول تخزين بارد للحصول على تركيز نهائي يتراوح بين 2 إلى 5 million من الخلايا الكبدية لكل milliliter. يمكن استخدام مقايسة trypan blue لقياس عدد الخلايا بدقة باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer).

تظهر هنا خلايا كبدية مصبوغة بصبغة تريبان الزرقاء (trypan blue) من 648 عملية عزل. بلغ متوسط حيوية الخلايا الكبدية البشرية المعزولة 77 ± 10%. وكان متوسط عائد الخلايا الكبدية 13 ± 11 مليون خلية كبدية لكل جرام من الكبد باستخدام التألق المناعي. أما الخلايا الكبدية المعزولة التي صُبغت إيجابياً للألبومين باللون الأخضر فقد بلغت درجة نقاوتها 94 ± 1% لتحديد نقاوة الخلايا الكبدية.

أُجري الصبغ المناعي الفلوري أربع مرات مع خمس مكررات لكل تجربة. يوضح مجهر تباين الأطوار الخصائص المورفولوجية للخلايا الكبدية مثل حجم خلاياها الكبير وشكلها المضلع. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل الخلايا الكبدية البشرية باستخدام إجراء تروية بالكولاجيناز يتكون من خطوتين.