التحكم الكمي والزمني للأكسجين المكروية في جزيرة واحدة المستوى

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق نقص أكسجة متقطع مقاس بدقائق على جزر بنكرياسية مقاسة بمقاييس مجهرية لبحث تأثيرات التكييف المسبق. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع جهاز ميكروفلويديك متعدد الوسائط مزود بغشاء رقيق نفاذ للغازات. وتتمثل الخطوة الثانية في إنشاء نظام محوسب لتنظيم الأكسجين.

بعد ذلك، يتم تحميل العينات العينية (eyelets) بعناية في الجهاز، ثم يتم توصيل الأنظمة الموائعية الدقيقة للسوائل والأكسجين. وتتمثل الخطوة النهائية في تنسيق المجهر مع الأنظمة الموائعية الدقيقة متعددة الأنماط من أجل تصور معاملات العينات العينية التي تتغير أثناء تعديل مستويات الأكسجين. وفي النهاية، تُستخدم تقنية نقص الأكسجة المتقطع للعينات العينية لإثبات أن الاستجابة للجلوكوز تضعف بشكل واضح في حالات نقص الأكسجين.

بينما يمكن للتعديلات الزمنية لنقص الأكسجة أن تدرب العيينات على الاستجابة بضعف أقل في القصور. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الأكسجين المذاب أو استخدام غرفة نقص الأكسجة، في إمكانية توفير تركيز دقيق من الأكسجين للجفون في فواصل زمنية سريعة ودقيقة للغاية دون التعرض لإجهاد القص الناتج عن التدفقات المعقدة.

كما أنها تتيح المراقبة في الوقت الفعلي باستخدام الفحص الظاهري والمجهري. ويمكن لهذا النموذج المرجعي أن يساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال زراعة الخلايا الغضروفية، مثل تحديد أوجه القصور الناجمة عن نقص الأكسجة في مواقع الزراعة أو أنظمة التكييف المسبق لتحسين نتائج الزراعة. لذا، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول نقص الأكسجة في الخلايا الغضروفية.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنسجة وأجهزة أخرى مثل الجهاز العصبي المركزي، وأنسجة القلب، والكلية، وغيرها من الأعضاء المزروعة. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن العديد من عمليات تصنيع الجهاز والتعامل مع العروات (eyelets) تتضمن خطوات يصعب تعلمها بسبب الطبيعة البينية المبتكرة لهذه التقنية، رغم ما تنطوي عليه من تحديات أو اعتياد. ابدأ بتصنيع الطبقة الغطائية للجهاز الموائع دقيق القنوات (microfluidic device).

لإنجاز ذلك، صب PDMS الممزوج مسبقاً في طبق بتري فارغ حتى يصل الارتفاع إلى 1.5 millimeters، ثم قم بمعالجته عند 80 degrees Celsius لمدة ساعتين. بعد ذلك، قم بتصنيع طبقة الموائع الدقيقة للجلوكوز باستخدام قالب غرفة التدفق الغزير عن طريق الطلاء الدوراني لطبقتين من SU 8 21 50 بسمك 350 micron لكل منهما لتشكيل طبقة واحدة بسمك 700 micron على رقاقة سيليكون مقاس أربع بوصات. ثم عرضها للأشعة فوق البنفسجية UV باستخدام قناع ضوئي لطبقة الموائع الدقيقة للجلوكوز لنقل نمط القنوات الدقيقة إلى طبقة SU eight.

اشطف المنطقة غير المعرضة باستخدام مُظهر SU eight. بعد ذلك، صب خليط PDMS المجهز مسبقاً من DGAs فوق الـ MA حتى يصل الارتفاع إلى 3 mm، ثم قم بالمعالجة عند 80 °C لمدة ساعتين. بمجرد اكتمال المعالجة، قص طبقة الجلوكوز المائعية الدقيقة وفقاً للشكل المطلوب، واستخدم خرامة بحجم 2 mm لتشكيل منافذ المدخل والمخرج، بالإضافة إلى خرامة بقطر 8 mm للغرفة الرئيسية.

بعد ذلك، يتم تصنيع القالب الرئيسي للآبار الدقيقة لتثبيت الجفن عن طريق طلاء دوراني لطبقة من SU 8 2100 بسمك 100 micron فوق رقاقة سيليكون نظيفة مقاس أربع بوصات، ثم استخدام الليثوغرافيا فوق البنفسجية (UV lithography) لنقل نمط الآبار الدقيقة إلى هذه الطبقة. عند اكتمال القالب الرئيسي للآبار الدقيقة، يتم شطف المناطق غير المعرضة للأشعة باستخدام المظهر. أضف طبقتين من PDMS بسمك 100 micron عن طريق الطلاء الدوراني بسرعة 900 RPM لمدة 30 ثانية، ثم المعالجة لمدة 10 دقائق عند 80 °C لإنتاج كل طبقة.

بمجرد الانتهاء، قم بثقب منافذ الدخول والخروج بقطر 2 mm. أخيراً، قم بتصنيع القالب الرئيسي للموائع الدقيقة للغاز عن طريق تدوير SU 8 2100 للوصول إلى سمك 100 microns كما في الطبقة السابقة، ونقل أنماط الموائع الدقيقة للغاز مرة أخرى باستخدام الليثوغرافيا بالأشعة فوق البنفسجية UV. اغسل المنطقة غير المعرضة باستخدام المظهر.

بعد ذلك، صُب طبقة من PDMS بسمك 1.5 millimeter فوق القالب الرئيسي للموائع الدقيقة الغازية، ثم قم بمعالجتها عند 80 °C لمدة ساعتين. بعد ذلك، قم بقص PDMS لتشكيله باستخدام شفرة الحلاقة. ثم قم بثقب منافذ دخول وخروج بقطر two millimeter في طبقة الغطاء لتكون محاذية لمواقعها في الطبقات الأخرى لربط الطبقات المتعددة معاً.

أولاً، قم بتجهيزها عن طريق تنظيف الأسطح باستخدام شريط لاصق، وتعريضها لقوس كورونا (Corona arc)، ثم محاذاة الطبقات يدوياً بالترتيب التالي: أولاً، قم بربط الغشاء بطبقة الغاز السفلية بحيث تكون الآبار الدقيقة (micro wells) متجهة للأعلى. ثم قم بربط طبقة الموائع الدقيقة للجلوكوز فوق غشاء الآبار الدقيقة.

وأخيراً، قم بربط طبقة المدخل والمخرج في الأعلى تماماً، بما يضمن تغليف المجموعة بأكملها. وللمساعدة في تكوين رابطة محكمة، ضع ثقلاً مقداره 1 kg فوق المجموعة وقم بخبزها عند 100 °C لمدة ثلاث ساعات. ثم اختبر التسريب.

اختبر الجهاز عن طريق تحميل الماء في الطبقة المائية، ثم غمر الجهاز وتمرير الهواء عبر الطبقة الغازية باستخدام المحقنة مع البحث عن أي تسريبات. وأخيراً، قم بتعقيم الأجهزة الخالية من التسريبات عن طريق تمرير ethanol بتركيز 70% عبر الطبقة المائية لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين. جهز الموزعات الدقيقة من خلال توصيل أسلاك تحكم الموزعات الدقيقة بوحدات التشغيل المرفقة أولاً.

ثم قم بتوصيل المشغلات بلوحة الإدخال والإخراج الرقمية (digital IO board) عند المنافذ المقابلة لعناصر التحكم الخاصة ببرنامج lab view. بعد ذلك، قم بتوصيل مصادر طاقة تيار مستمر بجهد 5 فولت و20 فولت بنقاط التلامس المقابلة لها في وحدات التشغيل، وقم بتوصيل لوحة الإدخال والإخراج الرقمية بجهاز كمبيوتر محمول لتنفيذ أكواد lab view الخاصة بالتحكم في الغاز كما هو موضح في ملحق البروتوكول النصي المصاحب. ثم قم بتوصيل موزع دقيق واحد بالنيتروجين والموزع الآخر بالهواء المضغوط، على أن يحتوي كلاهما على 5%carbon dioxide، واضبط كلا الغازين على 2 PS.I، ثم قم بتوصيل مخرجات الموزعين في وصلة على شكل حرف T قبل الدخول إلى الجهاز الموائع الدقيقة (microfluidic device).

بعد ذلك، قم بتثبيت الجهاز على المنصة المسخنة لمجهر مقلوب مع توصيل غازات بأكسجين بنسبة 0% و21% بالجهاز. ثم ضع مستشعر أكسجين من الألياف الضوئية عند مخرج السوائل في الجهاز لقياس الأكسجين المذاب داخل المخرج في الوقت الفعلي. بعد ذلك، قم بتوصيل الجهاز بمضخة تمعجية وابدأ في تدفق المياه عبر الجهاز بمعدل 250 microliters per minute.

قم بتوصيف الاستجابة العابرة لتعديل الأكسجين عن طريق تدوير الموزعات الدقيقة بين 5% و 21% من الأكسجين. قم بتوصيل مضخة 연动ية بالجهاز الموائع الدقيقة وضع الأنابيب فوق لوح تسخين بدرجة حرارة 37 degree Celsius لتدفئة السائل قبل دخوله إلى جهاز الموائع الدقيقة. كما يجب توصيل منفذ المخرج لموائع الجلوكوز الدقيقة بجهاز جامع الأجزاء، ثم ابدأ بتشريح فئران C 57 black six وعزل جزر البنكرياس عن طريق الهضم بالكولاجيناز والفصل بتدرج الكثافة باستخدام F ccal كما هو موضح في الفيديوهات التالية المتاحة من JoVE بمجرد الانتهاء من عملية العزل.

قم بتحضين العيينات (eyelets) في وسط RPMI 1640 يحتوي على 10%FBS، و1% penicillin streptomycin، و20 millimolar heaps في أطباق بتري لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة. استخدم العينات في غضون يومين لضمان الحصول على نتائج متسقة. بعد ذلك، قم بتحضير محلول منظم كريبس رينجر بيكربونات (Krebs ringer bicarbonate buffer) طازج كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق، بحيث يكون هناك محلول واحد يحتوي على 2 millimolar glucose ومحلول آخر يحتوي على 14 millimolar glucose.

قم بتدفئة المحاليل في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter بوضعها في حمام مائي عند 37 degree Celsius. بعد ذلك، قم بتحضير صبغة العيينات المعزولة عن طريق إضافة 5 micromolar من 4:02 AM وDMSO و2.5 micromolar من RH 1 23 و100%ethanol إلى 2 milliliters من منظم Krebs الذي يحتوي على 2 millimolar من glucose. بعد ذلك، انقل العيينات باستخدام ماصة سعة 10 microliter واحضنها في الصبغة لمدة 30 دقيقة عند 37 degrees Celsius.

بمجرد إتمام الصبغ، قم بتحميل ٢٠ عينة تقريبًا من فتحات العين في الجهاز عبر مدخل القناة الدقيقة للجلوكوز. وجه فتحات العين إلى الغرفة عن طريق ضخ المحلول المنظم من المخرج رجوعًا إلى المدخل. بعد ذلك، قم بتروية فتحات العين والمحلول المنظم لمدة 10 minutes لغسل الأصباغ الزائدة.

أولاً، يتم تمرير محلول منظم بيكربونات كريبس رينجر بتركيز 2 millimolar عبر النظام لمدة خمس دقائق لتحديد خط الأساس الطبيعي للنبض. بعد ذلك، تُحفز الحجرة باستخدام محلول منظم الجلوكوز بتركيز 14 millimolar لمدة 15 دقيقة، يلي ذلك عملية غسل لمدة 15 دقيقة باستخدام محلول منظم الجلوكوز بتركيز 2 millimolar. وخلال هذه العملية، يتم تسجيل انبعاثين عند 510 nanometer عن طريق الإثارة عند 340 nanometers و 380 nanometers.

أيضاً، قم بتسجيل انبعاث RH 1 23 عند 530 نانومتر عن طريق استثارة الصبغة عند 480 نانومتر. ولتقليل الاضطرابات الحملية أثناء تعديل الأكسجين، قم بتطبيق تدفق للمحلول المنظم خلال خطوات التحفيز والغسيل، وتأكد من إيقاف التدفق في الخطوات الأخرى أثناء الاختبار. اجمع التدفق الخارج من مخرج الجلوكوز على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة لاستخدامها في تحليلات إضافية؛ وباستخدام نهج الموائع الدقيقة الموضح في هذا الفيديو، يمكن تنظيم النسبة المئوية للأكسجين المتدفق عبر غشاء PDMS الرقيق بسرعة باستخدام المحاقن الدقيقة المحوسبة.

إليك مثال على هذا التعديل الذي تتراوح مدته من دقيقة واحدة إلى ست دقائق. من الممكن أيضاً توفير تعديلات كمية للأكسجين بمدد زمنية أقل من دقيقة، تتراوح بين 2 و 8.5 جزء في المليون، عن طريق توفير أكسجين بنسبة تتراوح بين 5% و 21%. يمثل الخط الأزرق النسبة المئوية للأكسجين الموفر، بينما يمثل الخط الأخضر الأكسجين المذاب الناتج مقاساً بالأجزاء في المليون. عند تطبيق هذه الدورة لإنشاء حالة نقص أكسجة متقطع في العيينات (eyelets)، يمكن ملاحظة فوائد التهيئة المسبقة للعيينات ضد نقص الأكسجة مقارنة بالنبض الطبيعي غير المنتظم، وذلك من خلال ملاحظة تحسن نسبة الـ for بعد المعالجة. ويمكن ملاحظة تأثيرات نقص الأكسجة ونقص الأكسجة المتقطع في التجاوز (overshoot) وتخميد التذبذب في عوابر الكالسيوم، كما هو موضح هنا، حيث يمثل اللون الأزرق الاستجابة في حالة الأكسجة الطبيعية.

باللون الأحمر تظهر الاستجابة لنقص الأكسجين، والخط الأخضر يمثل الاستجابة المشروطة لنقص الأكسجين. تظهر هنا قياسات الكالسيوم، والجهد الميتوكوندري، والأنسولين. هذه هي نتائج المجهر الفلوري في الوقت الحقيقي ومقايسة EISA خارج الشريحة باستخدام التدفق الميكروفلويدي من النظام؛ وتساهم هذه النتائج معاً في بناء رؤية متعددة الأنماط لاستجابة الجلوكوز والأنسولين في ظل حالة نقص الأكسجين العابرة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في يومين إذا نُفذت بشكل صحيح؛ يوم واحد لتصنيع الجهاز وعزل خلايا الجفن، ويوم واحد لتجارب الجفن نفسها. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحقق من تركيز الأكسجين الذي يتم توفيره عن طريق مضاهاة جهاز قياس الغاز في الجهاز بعد تطويره. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المخرج الجنيني والفيزيولوجيا الدقيقة للأنسجة الأخرى لاستكشاف كيف يمكن لنقص الأكسجة وأنماط الأكسجين المؤقتة أن تؤثر على أمراض مثل السكري والاضطرابات القلبية الوعائية والعصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحكم في تعديل الأكسجين، والتعامل مع الأنسجة الدقيقة، واستخلاص قياسات متكررة وذات دلالة لنقص أكسجة الأنسجة باستخدام أجهزة مائعية دقيقة متعددة الوسائط.