رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل نواتج تحلل الخلايا المفردة باستخدام الفلورة أو المقايسات المناعية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء جهاز ميكروفلويديك وطلاء الغرفة الداخلية بالأجسام المضادة. ثم يتم تثبيت الخلايا المفردة في المصائد وتعريضها لكواشف مختلفة لتحفيز استجابة خلوية في خطوة ثانية.

يتم إغلاق صمام حلقي الشكل بسرعة، ثم يُدفق محلول التحلل (lysis buffer) عبر الجهاز. يُفتح الصمام حلقي الشكل لفترة قصيرة، مما يؤدي إلى تحلل الخلايا داخل الغرفة الدقيقة، وهو ما يسمح للبروتينات المتحررة بالارتباط بالأجسام المضادة بتركيز عالٍ نظراً لصغر الحجم. بعد ذلك، يُفتح الصمام حلقي الشكل.

يتم غسل الحجرة، ثم تُضاف كواشف الكشف في الحجرة الدقيقة المغلقة. وتتم مراقبة الزيادة في شدة الفلورة بمرور الوقت باستخدام مجهر فلوري، وتُظهر النتائج قدرة هذا النظام على كشف المادة التحليلية المستهدفة المنطلقة من الخلايا الفردية بشكل كمي وموثوق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تحليل الخلية الواحدة.

وعلى وجه الخصوص، فقد افتقرت إلى الاستقصاءات المنهجية حول الاستجابة الخلوية للتغيرات في البيئة الكيميائية. ويمكننا ملاحظة تنظيم تصاعدي أو تنازلي للجزيئات داخل الخلوية نتيجة للمحفز الكيميائي. وهناك ميزتان رئيستان لهذه التقنية.

أولاً، يمكننا تعريض الخلايا المثبتة لبيئة كيميائية محددة تكون ثابتة أو متغيرة بشكل دوري. ثانياً، يمكننا إجراء تحليل عالي الحساسية والنوعية للحالة دون أي تلوث خلطي أو فقدان للمواد التحليلية بسبب النقل. للبدء، قم بتصنيع رقاقات SU-8 الرئيسية الثلاث المختلفة كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب.

سيتم استخدام أحدها لإنشاء الطبقة المائعية، والثاني للطبقة التحكمية، والثالث لختم التلامس الدقيق. بعد ذلك، يتم تصنيع الرقائق الموائعية الدقيقة بدءاً بتحضير خليط بنسبة 10 إلى 1 من PDMS وعامل المعالجة. اخلط كلا الجزئين بقوة وقم بتفريغ الغازات من المحلول لمدة 30 دقيقة أو حتى يصبح الخليط خالياً من الفقاعات.

بعد ذلك، ضع الرقاقة ضمن طبقة التحكم داخل طبق بتري وثبتها بشريط لاصق في القاع. صب حوالي 50 grams من PDMS في الأعلى لتكوين طبقة بسمك يتراوح بين أربعة إلى خمسة مليمترات، ثم ضع الرقاقة في فرن عند 80 °C لمدة ساعتين على الأقل لضمان التصلب الكامل لـ PDMS. كرر الإجراء نفسه لرقاقة الطباعة بالتلامس الدقيق، ولكن استخدم حوالي 20 grams من PDMS بدلاً من 50، مما ينتج عنه طبقة من PDMS بسمك يتراوح بين أربعة إلى خمسة مليمترات.

لتحضير الطبقة السفلية، قم بطلاء طبقة من PDMS بسمك 40 ميكرون باستخدام الطلاء الدوراني على الرقاقة التي تحتوي على الطبقة الموائعية الدقيقة. استخدم سرعة دوران قدرها 2000 RPM لمدة 60 ثانية. قم بمعالجة طبقة PDMS في الفرن لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 80 °C بعد معالجة جميع الأجزاء.

قم بإزالة طبقة التحكم من الرقاقة وقطعها إلى قطع باستخدام شفرة حلاقة. بعد ذلك، قم بعمل ثقوب توصيل الضغط باستخدام خرم خزعة بحجم 1 mm، ثم غطِ القنوات بشريط لاصق للتخزين. تالياً، قم بإزالة PDMS من فوق رقاقة الطباعة بالتلامس الدقيق، وجهز أختاماً تكون بمساحة منطقة الغرفة.

تُحفظ في درج بعيداً عن الغبار حتى وقت الاستخدام. بعد ذلك، يُوضع الرقاقة المطلية بالتدوير والطبقة الضابطة التي يتراوح سمكها بين أربعة إلى خمسة مليمترات في جهاز تنظيف بالبلازما. تُعرّض القطع لبلازما الأكسجين عند 0.75 millibar وبقدرة 18 watts لمدة 45 seconds.

بعد المعالجة بالبلازما، قم بمحاذاة الطبقتين بسرعة تحت مجهر ذي مسافة عمل كبيرة. أضف بعض الـ PDMS الإضافي حول الأجزاء العلوية الموضوعة لتسهيل إزالة الـ PDMS من الرقاقة. ثم ضع الرقاقة في فرن عند 80 °C لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بمجرد إتمام عملية المعالجة، استخدم مشرطاً لإزالة PDMS بعناية من الرقاقة وقص الرقائق الدقيقة، ثم قم بتثقيب فتحات الوصول للتوصيلات المائعية باستخدام مخرز خزعة بقطر 1.5 millimeter. بالإضافة إلى ذلك، قم بإنشاء خزان في الرقاقة الدقيقة عن طريق قص الجزء العلوي من رأس ماصة سعة 200 microliter واستخدام كمية من PDMS شبه المعالج، ثم قم بلصقه في الأعلى.

بعد ذلك، يتم معالجة الشريحة في الفرن عند 80 degrees Celsius لمدة ساعة واحدة على الأقل. ابدأ بتنظيف شريحة زجاجية وأجزاء PDMS. نظف الشريحة الزجاجية باستخدام الصابون.

اشطفه بالماء المقطر، ثم مرة أخرى بالإيثانول. جفف الشريحة باستخدام تيار من النيتروجين. استخدم شريطاً لاصقاً لإزالة أي شوائب أو جزيئات غبار من الـ PDMS.

بعد ذلك، ضع جزء PDMS والزجاج المنظف. قم بإدخالهما في جهاز تنظيف البلازما لمدة 45 ثانية بقدرة 18 وات لضمان الربط المحكم، ثم ضع الشريحة على لوح تسخين لمدة خمس دقائق بعد المعالجة بالبلازما. بعد عملية الربط، اقطع الجزء السفلي من عدد قليل من رؤوس الماصات سعة 200 microliter. املأها من 10 إلى 15 microliters من محلول PBS المفلتر المحتوي على 4%BSA وضعها في مداخل الجهاز.

بعد ذلك، استخدم رؤوس ماصات مقطوعة مضاف إليها من 10 إلى 15 µL من PBS وضعها في قنوات التحكم. بعد ذلك، ضع الرقائق في جهاز الطرد المركزي وقم بتدويرها عند 800 ×g لمدة خمس دقائق لملء القنوات بالسائل. إذا بقي هواء في أي من القنوات، كرر هذه الخطوة حتى تمتلئ القنوات تماماً.

يتم تحضين محلول الحجب لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم يُغسل المحلول من الطبقة السائلة باستخدام PBS بمعدل تدفق 10 microliters في الدقيقة. باستخدام مضخة حقنة، يصبح الجهاز الآن جاهزاً لتجارب الخلايا؛ ولطباعة الشريحة الزجاجية مسبقاً من أجل المقايسات المناعية، يتم تحضين أختام الطباعة الدقيقة المصنوعة من PDMS مع 0.5%biotinylated BSA في طبق بتري نظيف.

بعد مرور نصف ساعة، نظف الأختام جيداً وبسرعة باستخدام الماء المقطر، ثم جفف الختم تحت تيار من النيتروجين. وبمجرد جفافه، ضع الأختام بسرعة على شريحة زجاجية نظيفة لترسيب BSA المبيوتَن المُنقّش. لا تحرك الختم بعد وضعه، وتأكد من ملامسته للشريحة الزجاجية.

إذا لم تلتصق قليلاً، انقر على الختم، ولكن لا تضغط بقوة. ثم ضع الختم مع الجزء العلوي من الشريحة المائعية الدقيقة في غرفة البلازما وعرضهما لبلازما الأكسجين بقدرة 18 watts لمدة 45 seconds. بعد المعالجة بالبلازما، قم بإزالة الختم من الشريحة الزجاجية.

سيؤدي التنفس على السطح إلى جعل النمط مرئياً. قم بمحاذاة الغرف الدقيقة فوق السطح المطبوع. وبمجرد المحاذاة، ضع الشريحة على لوح ساخن عند 50 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة لحجب السطح المتبقي، ثم أدخل محلول BSA المفلتر والمعقم بتركيز 4% في PBS إلى الشريحة باستخدام جهاز طرد مركزي كما تم توضيحه سابقاً، واحضن الشريحة الدقيقة لمدة 30 دقيقة على الأقل، ثم اغسل المحلول من الطبقة السائلة باستخدام PBS بمعدل تدفق قدره 10 microliters في الدقيقة.

باستخدام مضخة حقنة، استخدم الشريحة مباشرة أو بعد تخزينها لمدة تصل إلى أسبوعين عند درجة حرارة 4 °C في صندوق رطب. بعد ذلك، قم بإنشاء سطح ارتباط فعال بالكامل عن طريق إدخال avadon في محلول PBS في الخزان. قم بتدفق المحلول لسحب avadon عبر القنوات السائلة بعد ذلك.

اغسل الخزان جيداً واشطف القنوات بمحلول PBS. بعد ذلك، أضف البروتين G إلى الخزان واسحبه عبر القنوات. اغسل أي فائض من البروتين G عن طريق شطف الخزان والشريحة بمحلول PBS.

بعد ذلك، أضف الجسم المضاد المطلوب إلى الخزان ومرره عبر القنوات. ثم أوقف التدفق للسماح بالارتباط قبل غسل القنوات باستخدام PBS. يمكن استخدام نظائر موسومة فلورياً للتحقق من جودة عملية الطباعة قبل إدخال الخلايا في القنوات. قم بحصد الخلايا الملتصقة، مثل خلايا HE 2 9 3 الموضحة هنا، باستخدام محلول تفكيك خالٍ من الإنزيمات، ثم قم بترشيحها لتقليل عدد التجمعات الخلوية، وبمجرد ترشيحها، قم بتحميلها في حقنة.

بتركيز 300, 000 خلية لكل ملليلتر، يتم تحميل الخلايا على الشريحة باستخدام التدفق الأمامي في مضخة السرنجة لمدة ثلاث دقائق تقريباً بمعدل 10 إلى 20 µL في الدقيقة بالنسبة للخلايا اللاصقة مثل هذه، وذلك لمنع الالتصاق غير النوعي للخلايا. عند امتلاء المصائد، تُغلق الحجرات عن طريق ضغط الطبقة العلوية بضغط قدره 3 bar. ثم تُفحص الحجرات باستخدام المجهر؛ وإذا تبين وجود العديد من الخلايا التي التصقت بشكل غير نوعي بالسطح داخل الحجرات، يتم فتحها بسرعة ومحاولة غسلها باستخدام محلول تفكيك الخلايا بمعدل تدفق يتراوح من 10 إلى 30 µL في الدقيقة.

بالنسبة لمقايسة جلوكوز-6-فوسفات ديهايدروجيناز (G6PDH)، أضف جلوكوز-6-فوسفات بتركيز 2 mM، وADP بتركيز 0.5 mM، وG6PDH بتركيز 0.5 units/mL، وNAD+ بتركيز 0.3 mM إلى محلول التحلل (lysis buffer) مع التأكد من خلطه جيداً. وبمجرد خلو القنوات، اسحب محلول تحلل G6PDH عبر الشريحة بمعدل تدفق قدره 30 µL/min. وأثناء تدفق محلول التحلل، افتح وأغلق الحجرات بسرعة، مع تركها مفتوحة لمدة 500 ms للسماح لمحلول التحلل بالدخول إلى الحجرة، ثم ابدأ مباشرة بعد التحلل في مراقبة التفاعل الحركي.

في هذا المثال، يمكن مراقبة منتج فلوري بمرور الوقت. يظهر هنا مصفوفة من الغرف التي مُلئت بصبغة طعام برتقالية ثم أُغلقت عن طريق ضغط طبقة التحكم الموجودة فوق الغرف الدقيقة. وبعد إغلاق الغرف، شُطفت صبغة طعام خضراء عبر القنوات لإظهار مدى إحكام إغلاق الغرف.

تحتوي كل حجرة على حجم لا يتجاوز 625 picoliters من السائل، مما يحافظ على تركيز الجزيئات المتحررة من الخلايا المتحللة بمستوى عالٍ بما يكفي لإجراء التحليل. علاوة على ذلك، يمكن فتح الصمامات وإغلاقها بطريقة تمنع حدوث التلوث الخلطي بين الحجرات. ومن الممكن داخل هذه الحجرات قياس المواد المراد تحليلها، مثل كمية الليزوزوم المتحررة من خلية U 9 37 واحدة منشطة بواسطة PMA، حيث يقوم الليزوزوم بتحفيز إنتاج جزيء فلوري داخل الحجرة إنزيمياً.

تمثل الخطوط الخضراء التغير في شدة الفلورة بمرور الوقت للغرف التي تشغلها خلية واحدة. كما يظهر أيضاً شدة الفلورة لغرفة خالية من الخلايا، والتي يمثلها الخط الأسود المنقط. وللمقارنة، يوضح هذا المقايسة تأثير جزيء سام على سلامة الغشاء عن طريق قياس إنزيم داخل خلوي وهو G six PDH.

يمثل الخط الأسود عينات الضبط التي لم تتعرض لأي تأثير سام، بينما يمثل الخط البرتقالي الخلايا المتأثرة بالسم الموضح. فيما يلي مثال على مقايسة مناعية للبروتين داخل الخلايا. تم تثبيت أجسام مضادة GFP anti GFP على السطح، وبمجرد تحلل الخلايا، تم تصور حركية ارتباط بروتينات GFP باستخدام مجهر turf.

تشير النقطة الزمنية 0.1 إلى إضافة محلول التحلل (lysis buffer)، وفي النقطة الزمنية 0.2 يبدأ GFP في التراكم على السطح، مما يعني حدوث تحلل للخلايا وانتشار GFP إلى السطح. يكتمل ارتباط GFP بالأجسام المضادة عند النقطة الزمنية 0.3. وفي هذا المثال النهائي، ارتبط GA DH المتحرر بالأجسام المضادة الماصة على السطح، ثم أضيفت أجسام مضادة كاشفة مقترنة بـ HRP.

بمجرد غسل جميع أجسام الكشف المضادة غير المرتبطة، تم إدخال كاشف الكشف وترك التفاعل لفترة زمنية. إليكم مقارنة لكمية GA DH التي كانت داخل الخلايا سابقاً في كميات حيوانية بين خلايا U 9 37 وخلايا HEC 2 93 المقاسة باستخدام هذه الطريقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الرقائق الموائعية الدقيقة، وكيفية تعديل السطح لتمكين المقاييس المناعية، وأخيراً، كيفية استخدام الجهاز لتحليل الخلية الواحدة.

يمكن استخدام هذه الطريقة للمساعدة في الإجابة على العديد من الأسئلة الجوهرية في مجال بيولوجيا الخلية الواحدة.