رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل تحلل الخلايا المفردة باستخدام التألق أو المقايسات المناعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء جهاز ميكروفلويديك أولا وطلاء الغرفة الداخلية بالأجسام المضادة. ثم يتم تثبيت الخلايا المفردة في المصائد وتتعرض لكواشف مختلفة لتحفيز الاستجابة الخلوية في الخطوة الثانية.

يتم إغلاق صمام الشكل الدائري بسرعة ويتم تدفق المخزن المؤقت للتحلل عبر الجهاز. يتم فتح الصمام على شكل حلقة لفترة قصيرة ويتم تحلل الخلايا داخل الغرفة الدقيقة ، مما يسمح للبروتينات المنبعثة بالارتباط بالأجسام المضادة بتركيز عال بسبب صغر حجمها. بعد ذلك ، يتم فتح الصمام على شكل حلقة.

يتم غسل الغرفة ، ويتم إدخال كواشف الكشف في الغرفة الدقيقة المغلقة. تتم مراقبة زيادة شدة التألق بمرور الوقت باستخدام المجهر الفلوري ، وتوضح النتائج قدرة هذا النظام على الكشف الكمي والموثوق عن مادة تحليل ذات أهمية يتم إطلاقها من الخلايا الفردية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تحليل الخلية المفردة.

على وجه الخصوص ، تناولت تحقيقات منهجية حول الاستجابة الخلوية للاختلافات في البيئة الكيميائية. يمكننا أن نرى اللوائح الصعودية أو المنخفضة للجزيئات داخل الخلايا نتيجة للتحفيز الكيميائي. هناك ميزتان رئيسيتان لهذه التقنية.

الأول هو أنه يمكننا تعريض الخلايا الجمودة لبيئة كيميائية محددة ثابتة أو متغيرة بشكل دوري. ثانيا ، يمكننا إصلاح التحليل شديد الحساسية والمحدد للدولة دون أي تلوث متبادل أو فقدان للتحليلات بسبب النقل. للبدء ، قم بتصنيع رقائق SU الثمانية الرئيسية الثلاثة المختلفة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

سيتم استخدام أحدهما لإنشاء الطبقة السائلة ، والآخر لطبقة التحكم ، والثالث لختم التلامس الصغير. ثم قم بتصنيع رقائق الموائع الدقيقة بدءا من تحضير خليط من 10 إلى واحد من PDMS وعامل معالجة. اخلطي كلا الجزأين بقوة وأزيلي المحلول لمدة 30 دقيقة أو حتى يصبح الخليط خاليا من الفقاعات.

بعد ذلك ، ضع الرقاقة داخل طبقة التحكم داخل طبق بتري وقم بلصقها في الأسفل. صب ما يقرب من 50 جراما من PDMS في الأعلى لعمل طبقة بسمك أربعة إلى خمسة ملليمترات ووضع الرقاقة لمدة ساعتين على الأقل في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لضمان المعالجة الكاملة ل PDMS. كرر نفس الإجراء لرقاقة طباعة التلامس الصغير ، ولكن استخدم ما يقرب من 20 جراما من PDMS بدلا من 50 ، مما ينتج عنه طبقة بسمك أربعة إلى خمسة ملليمترات من PDMS.

لتحضير الطبقة السفلية ، قم بتغطية طبقة PDMS بارتفاع 40 ميكرون على الرقاقة بطبقة الموائع الدقيقة. باستخدام سرعة دوران تبلغ 2000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. قم بمعالجة طبقة PDMS في الفرن لمدة ساعة عند 80 درجة مئوية عندما تلتئم جميع الأجزاء.

قم بإزالة طبقة التحكم من الرقاقة وقطعها إلى قطع باستخدام شفرة الحلاقة. ثم قم بثقب فتحات توصيل الضغط باستخدام ثقب خزعة بملليمتر واحد وقم بتغطية القنوات بشريط لاصق للتخزين. بعد ذلك ، قم بإزالة PDMS من فوق رقاقة الطباعة ذات التلامس الصغير وقم بإعداد طوابع بحجم مساحة الغرفة.

قم بتخزينها خالية من الغبار في درج حتى الاستخدام. ثم ضع الرقاقة المطلية بالدوران وطبقة التحكم التي يبلغ سمكها من أربعة إلى خمسة ملليمترات في منظف البلازما. قم بتعريض القطع عند 18 واط لمدة 45 ثانية باستخدام بلازما الأكسجين عند 0.75 ملليبار.

بعد العلاج بالبلازما ، قم بمحاذاة كلتا الطبقتين بسرعة تحت المجهر بمسافة عمل كبيرة. أضف بعض PDMS الاحتياطية حول الأجزاء العلوية الموضوعة لتسهيل إزالة PDMS من الرقاقة. ثم ضع الرقاقة في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل.

بمجرد الشفاء ، استخدم مشرطا لإزالة PDMS بعناية من الرقاقة ولقطع فتحات الوصول المثقوبة للرقائق الدقيقة للوصلات السائلة باستخدام ثقب خزعة 1.5 ملم. بالإضافة إلى ذلك، قم بإنشاء خزان في الرقاقة الدقيقة عن طريق قطع الجزء العلوي من طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر واستخدام بعض أجهزة PDMS شبه المعالجة الاحتياطية. ألصقه في الأعلى.

ثم عالج الرقائق في الفرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. ابدأ بتنظيف شريحة زجاجية وأجزاء PDMS. نظف شريحة زجاجية بالصابون.

شطفه بالماء المقطر ، ثم مرة أخرى بالإيثانول. جفف الشريحة باستخدام تيار النيتروجين. استخدم الشريط لإزالة أي حطام وجزيئات غبار من نظام إدارة الكثافة السياسية.

ثم ضع جزء PDMS والزجاج النظيف. انزلق في منظف البلازما لمدة 45 ثانية عند 18 واط لضمان ترابط محكم ، ضع الشريحة على لوح ساخن لمدة خمس دقائق بعد معالجة البلازما بعد الترابط ، قم بقطع الجزء السفلي من عدد قليل من أطراف الماصة سعة 200 ميكرولتر. املأها ب 10 إلى 15 ميكرولترا من PBS المفلترة بنسبة 4٪ BSA وضعها في مداخل الجهاز.

ثم استخدم أطراف القطع مع إضافة 10 إلى 15 ميكرولتر من PBS وضعها في قنوات التحكم. بعد ذلك ، ضع الرقائق في جهاز الطرد المركزي وقم بتدويرها بجاذبية 800 مرة لمدة خمس دقائق لملء القنوات بالسوائل. إذا بقي الهواء في أي من القنوات ، كرر هذه الخطوة حتى تمتلئ القنوات بالكامل.

احتضان محلول الحجب لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل المحلول من طبقة السائل باستخدام PBS بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة. باستخدام مضخة حقنة ، أصبح الجهاز جاهزا الآن لتجارب الخلايا للطباعة المسبقة للشريحة الزجاجية للمقايسات المناعية التي تحتضن طوابع طباعة التلامس الدقيقة PDMS مع 0.5٪ بيوتينيل BSA في طبق بتري نظيف.

بعد نصف ساعة ، قم بتنظيف الطوابع جيدا وبسرعة بالماء المقطر وجفف الختم تحت تيار من النيتروجين. بمجرد أن تجف ، ضع الطوابع بسرعة على شريحة زجاجية نظيفة لإيداع BSA المزخرف بالبيوتينيل. لا تحرك الختم بعد وضعه وتأكد من ملامسة الختم للشريحة الزجاجية.

إذا لم يكن قليلا ، فاضغط على الختم ، لكن لا تضغط بقوة. ثم ضع الختم مع الجزء العلوي من شريحة الموائع الدقيقة في غرفة البلازما وقم بتعريضها لبلازما الأكسجين عند 18 واط لمدة 45 ثانية. بعد العلاج بالبلازما ، قم بإزالة الختم من الشريحة الزجاجية.

التنفس على السطح سيجعل النمط مرئيا. قم بمحاذاة الغرف الدقيقة أعلى السطح المطبوع. بمجرد محاذاتها ، ضع الشريحة على لوح ساخن عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لسد السطح المتبقي ، وأدخل محلول BSA معقم ومفلتر بنسبة 4٪ في PBS في الرقاقة باستخدام جهاز طرد مركزي كما هو موضح سابقا ، واحتضان الرقاقة لمدة 30 دقيقة على الأقل ثم اغسل المحلول من طبقة السائل باستخدام PBS بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة.

باستخدام مضخة حقنة ، استخدم الشريحة مباشرة أو تخزينها لمدة تصل إلى أسبوعين عند أربع درجات مئوية في صندوق رطب. بعد ذلك ، قم بإنشاء سطح ربط يعمل بكامل طاقته عن طريق إدخال avadon في PBS في الخزان. قم بتدفق المحلول لسحب أفادون عبر قنوات السوائل بعد ذلك.

اشطف الخزان جيدا واغسل القنوات باستخدام PBS. ثم أضف البروتين G إلى الخزان واسحبه عبر القنوات. اغسل أي بروتين زائد G عن طريق شطف الخزان والرقاقة باستخدام PBS.

بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد محل الاهتمام إلى الخزان وقم بتدفقه عبر القنوات. ثم أوقف التدفق للسماح بالربط قبل غسل القنوات باستخدام PBS بالفلورسنت ، ويمكن استخدام نظائرها المصنفة للتحقق من جودة عملية الطباعة قبل إدخال الخلايا في القنوات. قم بتجميع الخلايا الملتصقة مثل خلايا HE 2 9 3 الموضحة هنا باستخدام المخزن المؤقت الخالي من الإنزيم ، ثم قم بتصفيتها لتقليل عدد مجموعات الخلايا بمجرد تصفيتها ، وتحميلها في حقنة.

عند 300 ، 000 خلية لكل مليلتر ، قم بتحميل الخلايا على الرقاقة باستخدام التدفق الأمامي على مضخة الحقنة لمدة ثلاث دقائق تقريبا بمعدل 10 إلى 20 ميكرولتر في الدقيقة للخلايا اللاصقة مثل هذه من أجل منع التعلق غير المحدد للخلايا عند ملء المصائد ، أغلق الغرف عن طريق الضغط على الطبقة العليا بثلاثة أشرطة. ثم افحص الغرف باستخدام المجهر. إذا تبين أن العديد من الخلايا قد تلتصقت بشكل غير محدد بالسطح داخل الغرف ، فافتحها بسرعة وحاول غسلها باستخدام المخزن المؤقت لتفكك الخلايا بمعدل تدفق يتراوح من 10 إلى 30 ميكرولتر في الدقيقة.

بالنسبة للجلوكوز ستة نازعة هيدروجين الفوسفات أو مقايسة G ستة PDH ، أضف اثنين من الجلوكوز المليمولار ، وستة فوسفات 0.5 ملليمولار ، و DP 0.5 وحدة لكل مليلتر من مصفوفات DIA و 0.3 ملليمولار RIN إلى مخزن التحلل وتأكد من خلطه جيدا. بمجرد مسح القنوات ، ارسم المخزن المؤقت لتحلل G six PDH عبر الشريحة بمعدل تدفق 30 ميكرولتر في الدقيقة. أثناء تدفق المخزن المؤقت للتحلل ، افتح الغرف وأغلقها بسرعة ، واتركها مفتوحة لمدة 500 مللي ثانية للسماح للتحلل بالدخول إلى الغرفة فور بدء التحلل في مراقبة التفاعل الحركي.

في هذا المثال، يمكن مراقبة منتج الفلورسنت بمرور الوقت. تظهر هنا مجموعة من الغرف التي تم ملؤها بصبغة طعام برتقالية ثم تم إغلاقها عن طريق الضغط على طبقة التحكم فوق الغرف الصغيرة. بعد إغلاق الغرفة ، تم شطف صبغة الطعام الخضراء من خلال القنوات لإظهار ضيق الغرف.

تحتوي كل غرفة على حجم 625 بيكوليتر فقط من السائل الذي يحافظ على تركيز الجزيئات المنبعثة من خلايا ليس مرتفعا بما يكفي للتحليل. علاوة على ذلك ، يمكن فتح الصمامات وإغلاقها بطريقة تقضي على التلوث المتبادل بين الغرف. داخل هذه الغرف ، من الممكن قياس التحليلات مثل كمية الليزوسوم المنبعثة من خلية واحدة من خلايا PMA يتم تنشيطها U 9 37 ، لأنها تحفز إنزيميا إنتاج جزيء الفلورسنت داخل الغرفة.

تمثل الخطوط الخضراء التغير في شدة التألق بمرور الوقت للغرف التي تشغلها خلية واحدة. يظهر أيضا شدة التألق لغرفة بدون خلايا يمثلها الخط الأسود المنقط. للمقارنة ، يوضح هذا الاختبار تأثير جزيء سام على سلامة الغشاء عن طريق قياس إنزيم داخل الخلايا G six PDH.

يمثل الخط الأسود عينات التحكم التي ليس لها تأثير سام ، بينما يمثل الخط البرتقالي الخلايا المتأثرة بالسموم الموضحة. فيما يلي مثال على المقايسة المناعية للبروتين داخل الخلايا. تم تجميد الأجسام المضادة ل GFP المضادة ل GFP على السطح وبمجرد تحلل الخلايا ، تم تصور حركية الربط لبروتينات GFP باستخدام الفحص المجهري للعشب.

يشير الوقت 0.1 إلى إدخال المخزن المؤقت للتحلل في الوقت الذي بدأ فيه 0.2 GFP في التراكم على السطح ، مما يعني أن تحلل الخلية قد حدث وانتشر GFP على السطح. يكتمل ارتباط GFP بالأجسام المضادة في الوقت 0.3. في هذا المثال الأخير ، يرتبط GA DH المحرر بالتقاط الأجسام المضادة على السطح ثم تمت إضافة الأجسام المضادة للكشف المقترنة ب HRP.

بمجرد غسل جميع الأجسام المضادة للكشف غير المرتبط ، تم إدخال كاشف الكشف وكان التفاعل بمرور الوقت. فيما يلي مقارنة لكمية GA DH داخل الخلايا سابقا بكميات حيوانية بين خلايا U 9 37 و HEC 2 93 التي تم قياسها باستخدام هذه الطريقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير رقائق الموائع الدقيقة ، وكيفية تعديل السطح لتمكين المقايسات المناعية ، وأخيرا ، كيفية استخدام الجهاز لتحليل خلية واحدة.

يمكن استخدام هذه الطريقة للمساعدة في الإجابة على العديد من الأسئلة المثيرة في مجال بيولوجيا الخلية الواحدة.