البروتوكولات الأمثل ل

الهدف من هذا العمل هو توضيح كيفية تحضير معلق دهني من المتفطرات (mycobacterium) عالي الحيوية، وذلك لحقنه في الفئران العارية (nude mice). سنقوم باستخلاص المادة الحيوية الأساسية من فأر مصاب، ويفضل أن يكون ذلك خلال المرحلة المبكرة من العدوى.

لضمان الحصول على عيون ذات حيوية عالية، يتم قتل الحيوان الرحيم داخل كابينة السلامة البيولوجية. ثبت النبض الخلفي باستخدام ملاقط مرقئة. اقطعها مع حدوث تشنجات واغمرها في Iodine 2% لمدة 20 دقيقة لغرض التطهير، مع تثبيت نقطة الوضع بحيث تكون وسادة القدم متجهة للأعلى.

اجمع الأنسجة الرخوة باستخدام شفرة مشرط، وقم بإزالة عظام السلالم الأولى والخامسة لتسهيل تجانس النسيج. ضع النسيج في طبق بتري معقم، ثم اكشط طبقة البشرة.

قم بتقطيع النسيج الحبيبي إلى قطع صغيرة باستخدام المقص، وانتظر لحساب نسبة حصيلة النسيج لاحقاً. انقل القطع الصغيرة إلى أنبوب يحتوي على 1 ml من محلول هانك الملح المتوازن (Hank's balanced salt solution). أضف 1 ml إضافياً من محلول هانك، ثم قم بمجانسة النسيج ثلاث مرات لمدة 15 ثانية في كل مرة عند السرعة الرابعة.

ضع مصفاة خلايا في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ml. انقل المعلق باستخدام الماصة إلى المصفاة واترك المحلول يمر بفعل الجاذبية. وللتخلص من الحطام الخلوي، أضف 2 ml إضافيين من محلول hanks إلى المعلق وقم بتجانسه مرة أخرى.

باستخدام الدورة نفسها، مرر المعلق عبر هذه المصفاة. اشطف المصفاة بإضافة محلول hanks. ولجعل الحجم الإجمالي للمعلق 9 mL، أضف 1 mL من محلول tripsin بتركيز 0.5% إلى المعلق للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.05%.

امزج الخليط عن طريق قلب الأنبوب بلطف، ثم حضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد التحضين، أكمل حجم المعلق إلى 4 mL بإضافة محلول ملحي معقم، ثم قم بالطرد المركزي عند 1700 G لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية، وتخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب عن طريق النقر على الأنبوب. أضف 1 ml من المحلول الملحي المصلّي وامزجه.

انقل المعلق إلى أنبوب جديد. قم بتجانس المعلق الوعائي باستخدام حقنة إنسولين سعة 1 ml مع إبرة قياس 26 gauge أثناء نقل المعلق إلى أنبوب جديد. أجرِ الرقابة الميكروبيولوجية على المعلق عن طريق وضع قطرتين في وسط 18 medium، وسبع قطرات في وسط H nine brain heart infusion.

تُحضن 11 Stein Genesen عند 37 درجة مئوية. ثم تُتبع إجراءات الرقابة الميكروبيولوجية الروتينية. من أجل صبغ code Z.

قم بإعداد تخفيفات بنسبة 1 إلى 10 وبنسبة 1 إلى 100 لمعلق S في المحلول الملحي. قم بتجنيس كل تخفيف قبل تحضير هذه الشرائح للعد، وجهز ثلاث شرائح عن طريق رسم ثلاث دوائر بقطر داخلي 10 millimeter على سطح كل شريحة باستخدام قلم تحديد دائم.

الآن، قم بإحاطة الدوائر باستخدام قلم الكيمياء النسيجية المناعية. قم بتمييز هذه الشرائح باستخدام قلم رصاص رقم 2 لتجهيز الشرائح لثلاثة تركيزات تسلسلية: غير مخفف، و1 إلى 10، و1 إلى 100.

قم بسحب 5 µL من محلول مصل الفينول و10 µL من معلق sary في كل دائرة، ثم قم بالتجانس وتوزيع المعلق بالتساوي على كامل مساحة الدائرة. باستخدام مقبض حلقة نقل لمرة واحدة، ضع هذه الشرائح على طاولة مستوية لتجف. بعد الجفاف، قم بتثبيتها بتمرير هذه الشرائح ثلاث مرات فوق اللهب الأزرق مع توجيه معلقات bachelor للأعلى.

قم بإجراء تثبيت كود Zuni. افحص هذه الشرائح. التخفيفات الثلاثة.

اختر التخفيف الأكثر ملاءمة لعد sary. قم بتحضير 200 µL من معلق sary المقتول عن طريق تعقيم المعلق الوعائي بجهاز الأوتوكليف لمدة 30 دقيقة عند 121 °C. استخدم طقم L 7 0 0 7 live dead back light bacterial viability لفحص حيوية البكتيريا من أجل الصبغ الفلوري لليبيدات البكتيرية الدقيقة.

قم بتحضير تخفيف بنسبة 1:10 للمحلول A وتخفيف بنسبة 1:20 للمحلول B مباشرة قبل الاستخدام. أضف إلى كل 200 µL من المعلق الوعائي غير المخفف (الأصلي والمقتول) مقدار 3.6 µL من المحلول A المخفف و6 µL من المحلول B المخفف. بعد الحضانة لمدة 15 دقيقة في الظلام، قم بطرد مركبات المعلق باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 10,600 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. قم بإزالة الطافي باستخدام الماصة.

قم بتعليق الراسب في 50 µL من الجليسرول بتركيز 10%، ثم اجعله متجانساً عن طريق السحب والدفع بالمصّة. ضع ثمانية µL من كل معلق على شريحة زجاجية وغطها بغطاء شريحة صغير، مع حمايتها من الضوء.

افحص المعلقات تحت المجهر الفلوري. قم بتحضير معلق بتركيز يتراوح من 10 إلى 7 BA lip لكل ml، وضع 1 ml من وسط التجميد في كل أنبوب حفظ بالتجميد (cryo vial). ثم أضف 150 µL من المعلق S إلى الـ 1 ml من وسط التجميد وقم بتجانسه عن طريق قلب الأنبوب.

ضع الأنبوب المبرد (cryo vial) داخل حاوية التجميد. حافظ على درجة حرارة الحاوية عند 80- درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل. انقُل الأنابيب إلى صندوق تخزين واحفظها عند 80- درجة مئوية لحين الإذابة.

قم بإذابة المعلق المجمد في حمام مائي مضبوط عند 37 degrees Celsius. انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 20 mL من المحلول الملحى المعقم. ثم قم بالطرد المركزي للتركيز.

تم اتباع بروتوكول Z للحفاظ على العد، وبروتوكول التلوين الفلوري لتحديد الحيوية لعينات baline. يتم تحضير معلق يحتوي على 10 إلى 8 BA لكل وجبة، وتجانس المعلق قبل تلقيح كل حيوان. يتم سحب 100 µL في سرنجة إنسولين وتلقيح 30 µL في وسادات القدم الخلفية لكل حيوان في عملية تحديد الحيوية.

يُلاحظ الفلورة الخضراء في جميع الـ BAI والفلورة الحمراء فقط في bai. وعندما تكون الـ BAI بمثابة ضابط غير ملوث، تُلاحظ الشدة نفسها من ضوء BAI الأخضر والأحمر. أدى تلقيح M Lepar المجمدة لفترات مختلفة إلى زيادة تتراوح من 10 إلى 1000 ضعف في عدد الـ BAI المستعادة بعد سبعة أشهر.

وكملاحظة ختامية، نود أن نضيف أنه نظراً لأن IL leid لا ينمو في المختبر (in vitro)، فإن هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة وسهلة للحفاظ على yl Leid حيوياً ليكون متاحاً للاستخدامات اللاحقة في المختبر.