محرك عانى من قطع الأعصاب والوقت الفاصل بين التصوير من السلوكيات الخلايا الغروية في اسماك الزرد لايف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير سلوك الخلايا الدبقية عبر الزمن (time-lapse) عقب إصابة العصب الطرفي في يرقات سمك الزيبرفيش الحية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت يرقات الزيبرفيش المخدرة في أغار منخفض درجة الانصهار على أطباق بتري ذات قاع زجاجي، وتحديد موضعها باستخدام إبرة تشريح. بعد ذلك، توضع اليرقات المثبتة على المجهر البؤري (confocal microscope).

يتم اختيار عصب لإجراء الاستئصال، ويؤخذ تصوير للمحاور العصبية والخلايا الدبقية في العصب غير المصاب. بعد ذلك، يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) على طول العصب، ثم يُطلق الليزر لاستئصال المناطق المختارة مما يؤدي إلى قطع العصب. وأخيراً، يتم إجراء تصوير بالفواصل الزمنية (time-lapse) للمحاور العصبية والخلايا الدبقية بعد عملية قطع العصب.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تُظهر السلوك الديناميكي للخلايا الدبقية أثناء تنكس الأعصاب وتجددها من خلال المجهر البؤري بفاصل زمني. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات التجدد وبيولوجيا الخلايا الدبقية، مثل: كيف تستجيب الخلايا الدبقية لإصابة الأعصاب؟ وكيف تنسق الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا الدبقية سلوكها أثناء عمليتي التنكس والتجدد؟

بعد تهجين أسماك الزيبرا البالغة التي تحتوي على جينات منقولة تصبغ الخلايا العصبية الحركية وأنواع الخلايا الدبقية المستهدفة بفلورية، وتحضين الأجنة حتى 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، قم بإزالة مياه البيض واستبدالها بمحلول 1 pH phenylthiourea أو PTU في مياه البيض قبل إعادة الأجنة إلى الحاضنة. من هذه النقطة الزمنية وحتى حوالي 96 HPF، استخدم مجهر تشريح فلوري لفحص الأجنة للتأكد من وجود الجين الفلوري المطلوب. انقُل الأجنة الإيجابية إلى مياه بيض تحتوي على PTU جديدة وأعدها إلى الحاضنة.

عندما تصل اليرقات إلى اليوم السادس بعد الإخصاب (DPF)، اختر بضعة أجنة للتثبيت وانقلها إلى طبق أصغر. قم بإزالة الماء من الطبق واستبدله فوراً بماء بيض يحتوي على 0.02% trica In PTU، واترك اليرقات في المخدر لمدة خمس دقائق تقريباً. ضع كمية من 0.8% low melt agarose المحضرة مسبقاً وفقاً للبروتوكول النصي في دورق يحتوي على ماء صنبور وضعه في الميكروويف.

لمدة 30 ثانية أو حتى يذوب الـ agros، اترك الكأس ليبرد حتى يصبح أنبوب الـ agros فاترًا عند لمسه. بعد ذلك، انقل يرقة مخدّرة إلى طبق زجاجي قاعدته مسطحة بقطر 35 مليمتر. قم بإزالة أي ماء موجود في الطبق.

بعد ذلك، قم بتغطية اليرقات فوراً بكمية كافية من الأجار الدافئ لملء الجزء ذو القاعدة الزجاجية من الطبق. ومع تصلب الأجار، استخدم إبرة تشريح لوضع اليرقات على جانبها. ثم قم بإمالتها قليلاً على ظهرها، مع التأكد من أن اليرقات المثبتة تلامس الزجاج في قاع الطبق، وهو أمر ضروري لعمليتي الإصابة والتصوير.

استخدم الإبرة للحفاظ على وضعية اليرقات حتى يتصلب الآجار وتصبح اليرقة ثابتة. بعد ذلك، قم بسحب كمية كافية من ماء التريكا ببطء باستخدام الماصة إلى الطبق لتغطية الآجار واليرقات تماماً. قم بتشغيل جميع أجهزة المجهر confocal، وليزرات الديود المناسبة لإثارة الجينات المنقولة في سمك الزيبرا، وليزر الصبغة الذي يتم ضخه بالنيتروجين.

تأكد من وضع مقسم الشعاع الفارغ، ومن وضع خلية الصبغة ومصحح اللون بطول موجي 435 nanometer. افتح مخفف شدة الليزر بالكامل، ثم افتح برنامج التصوير باستخدام عدسة غمر مائية 63 x 1.2 na وشريحة زجاجية ذات جانب واحد عاكس. استخدم إضاءة المجال المضيء للعثور على خدش أو حز في المرآة والتركيز عليه.

باستخدام برنامج التصوير، قم بعرض وضبط تركيز النقوش على شاشة الكمبيوتر من خلال النافذة التي تتحكم في معايرة الليزر وإعدادات الطاقة. اضبط عدد النبضات على نبضة واحدة، ونسبة التوهين على 3% transmission من شريط الأدوات الرئيسي. اختر أداة الشكل البيضاوي وانقر على الصورة الموجودة على شاشة الكمبيوتر.

لإنشاء منطقة اهتمام (ROI) دائرية واحدة، كرر هذه العملية ثلاث مرات إضافية حتى يتوفر أربع مناطق اهتمام دائرية موزعة عشوائياً على الصورة. بعد ذلك، قم بتشغيل الليزر. إذا كان الليزر يعمل ومعايراً بشكل صحيح، فسيؤدي ذلك إلى إنشاء أربعة نقوش نقطية صغيرة، واحدة داخل كل منطقة اهتمام دائرية. ثم قم بإزالة الشريحة الزجاجية من منصة المجهر ونظف العدسة الشيئية.

استبدل مقسم الحزمة الفارغ بمقسم الحزمة 100%ILL لقطع عصب حركي باستخدام الاستئصال بالليزر. ضع قطرة صغيرة من وسط الغمر المائي على العدسة الشيئية، ثم ضع الطبق الذي يحتوي على اليرقة المثبتة على المنصة المناسبة باستخدام المشابك لتثبيتها، مستعيناً بالعدسة العينية والإضاءة واسعة المجال. قم بضبط التركيز على اليرقات وتحديد موقع العصبونات الحركية.

افحص الأعصاب في القطاعات النصفية من 10 إلى 20 واختر عصباً حركياً لقطعه. بعد ذلك، اعرض رؤية حية للعصب على شاشة الكمبيوتر. حدد مستويات Z والتقط صورة للمحاور العصبية والخلايا الدبقية للعصب غير المصاب.

ثم قم بضبط إعدادات التصوير بالفاصل الزمني لالتقاط مساقط Z لجميع أنواع الخلايا على فترات تتراوح بين 5 و30 دقيقة. وبناءً على التجربة، قم بإزالة مقسم الحزمة 100%ILL واستبداله بالقرص الفارغ. عُد إلى العرض المباشر للعصب واستخدم القناة الفلورية المناسبة لعرض المحاور العصبية التي سيتم قطعها.

باستخدام أداة الشكل البيضاوي، قم بإنشاء منطقة اهتمام (ROI) بيضاوية رقيقة في المنطقة المراد استئصالها. ثم قم بإنشاء مناطق اهتمام أصغر ضمن المنطقة المحددة في النافذة التي تتحكم في إعدادات الليزر. اضبط عدد النبضات على اثنتين ولوحة التوهين على 18% transmission.

بعد ذلك، قم بتشغيل الليزر داخل مناطق الاهتمام (ROIs) المختارة. انتظر لمدة 10 ثوانٍ أو أكثر ثم افحص المنطقة المستأصلة مرة أخرى للتأكد من وجود الفلورة. ضع في اعتبارك أن منطقة الاهتمام قد تبدو في البداية مستأصلة بينما تكون في الواقع قد تعرضت للتبييض الضوئي، وقد يتطلب الأمر تعديل مناطق الاهتمام قليلاً أثناء عملية الاستئصال لتحقيق قطع عرضي كامل.

إذا عادت الفلورة، قم بزيادة قدرة الليزر ثم أطلق الليزر. كرر هذه العملية مجدداً حتى تختفي الفلورة داخل R OIS ولا تعود خلال 10 ثوانٍ. وبمجرد اكتمال الاستئصال، ابدأ بالتصوير المتقطع (time-lapse imaging) عند انتهاء التصوير المتقطع.

استخدم برنامج التصوير لتجميع البيانات وإنشاء مساقط Z مركبة وملونة لكل نقطة زمنية. قم بإنشاء مقطع فيديو سريع (QuickTime movie) لتحليل سلوك المحاور العصبية والخلايا الدبقية في وقت واحد. يمكن استخدام المقايسة الموصوفة هنا لتقييم استجابة الخلايا الدبقية ومجموعات الخلايا الأخرى المرتبطة بالأعصاب للإصابة المحورية في الجسم الحي (in vivo).

يظهر هنا مثال لإصابة عصبية تم إحداثها باستخدام هذه الطريقة واستجابة الخلايا الدبقية المحيطة بها. أجريت التجربة على أسماك zebra fish معدلة وراثياً في اليوم السادس من تطور الجنين (DPF)، والتي عبرت عن EGFP مستهدف للغشاء في ggl المحيط بالعصب، و DS red سيتوبلازمي في العصبونات الحركية. أحدثت الإصابة على طول الإسقاط المنقاري لعصب حركي جذعي، ثم تم تصويرها بنظام التصوير الزمني (time-lapse) في كل من قناتي EGFP و DS red.

أتاح ذلك التصوير المتزامن لسلوكيات المحاور العصبية والخلايا الدبقية فور حدوث الإصابة. وتعد هذه الصور نقاطاً زمنية ثابتة مأخوذة من فيلم التصوير الزمني. يوضح الشكل البيضاوي المنقط المنطقة ذات الاهتمام (ROI) التي تم استئصالها باستخدام الليزر عند الدقيقة الأولى.

بعد عملية القطع العرضي أو في نقطة زمنية محددة بعد القطع (MPT)، افتقرت المنطقة المستأصلة إلى الفلورة، وبلغ قياس منطقة الإصابة حوالي 3.5 micrometers من الطرف الداني إلى الطرف القاصي. ويمكن تأكيد نجاح عملية القطع العرضي من خلال تصوير الطرف القاصي للعصب والبحث عن علامات التنكس والليري (wallerian degeneration)، بما في ذلك تفتت المحاور القاصية والتلاشي السريع. ويشير غياب الفلورة المحورية على طول الطرف القاصي عند 120 MPT إلى أن هذه المحاور قد خضعت بالفعل للتنكس والليري وأن عملية القطع كانت ناجحة.

يُعد ضبط قدرة الليزر للوصول إلى الإعداد المثالي أمراً بالغ الأهمية عند إجراء تجارب الاستئصال بالليزر. حيث ستعمل إعدادات قدرة الليزر المثالية على استئصال العصب بدقة فقط ضمن منطقة الاهتمام (ROI) المختارة، بينما ستؤدي إعدادات قدرة الليزر المنخفضة جداً أو العالية جداً إلى نتائج غير مرضية؛ وما يظهر هنا هو إصابة تم إجراؤها بقدرة ليزر منخفضة للغاية. فقد ظل الفلورسنت موجوداً ضمن منطقة الاهتمام بعد إطلاق الليزر، مما أدى إلى قطع غير مكتمل.

ومن ناحية أخرى، وكما هو موضح في هذا الشكل، فإن استخدام قدرة ليزر عالية جداً قد أدى إلى حدوث استئصال كبير للغاية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت zebrafish لإجراء تجارب القطع بالليزر. قم بإجراء قطع باستخدام ليزر صبغي بمضخة نيتروجين، ثم قيم استجابة الخلايا المحيطة باستخدام التصوير المجهري البؤري بنظام الفاصل الزمني.