الآلي التحليلات السلوكية عالية الإنتاجية في يرقات اسماك الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد العيوب السلوكية في يرقات الزرد بعد العلاج بالمواد السامة أو الأدوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع الأجنة أو اليرقات أولا ومعالجتها بالمواد الكيميائية حتى الأيام السبعة الأولى من النمو. الخطوة الثانية هي إنشاء ممرات سباحة زراعية باستخدام قوالب مصممة خصيصا.

بعد ذلك ، يتم وضع اليرقات المعالجة في ممرات agros للتحليل السلوكي باستخدام التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني. تتمثل الخطوة الأخيرة في استيراد الصور إلى الصورة J واستخدام ماكرو محدد مكتوب داخليا من أجل جمع بيانات إحداثيات XY لليرقات في الممرات. في النهاية ، يتم استخدام الاختبار السلوكي عالي الإنتاجية للعثور على الاختلافات في سلوك التجنب ومحور figma ، وكذلك في سرعة السباحة والراحة بين مجموعات العلاج.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل تلك المتاحة تجاريا هي أنه يمكننا استخدام طريقتنا لمراقبة سلوكيات أكثر تعقيدا. كما أنها غير مكلفة للبناء وسهلة الإعداد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب السلوكي ، مثل كيفية تأثير المواد السامة على نمو الدماغ وسلوكه أثناء التعرض المبكر للجنين.

يمكن أن يوفر أيضا نظرة ثاقبة لعيوب الدماغ الدقيقة لدى البشر ، والتي لا يمكن العثور عليها بواسطة شاشات السمية الحالية الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن اصطياد اليرقات قد يكون صعبا. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الخطوات لها منحنى تعليمي لأن البروتوكول يتضمن أنظمة مصممة خصيصا.

لبدء هذا الإجراء ، أدخل أطباق Pyrex الزجاجية مع العشب المزيف المصنوع من الخيوط الخضراء في الخزانات. عند الفجر ، اترك الأطباق في الخزانات لمدة ساعتين لجمع أجنة الزرد. صب الأطباق الزجاجية التي تحتوي على الأجنة فوق مصفاة محمولة بالماء منزوع الأيونات.

بعد ذلك ، قم بزراعة الأجنة في ماء البيض الذي يحتوي على 60 ملليغرام لكل لتر من المحيط الفوري في الماء منزوع الأيونات و 0.25 ملليغرام لكل لتر من الميثيلين الأزرق ، والذي يستخدم كمثبط للعفن. يمكن وضع الأجنة في 50 إلى 60 يرقة لكل 50 مل أو في خزانات تكاثر أكبر حتى تصبح الأجنة جاهزة للمعالجة بالمواد السامة. اعتمادا على فرضية التجربة الفردية ، يمكن معالجة الأجنة على الفور أو خلال مراحل محددة من التطور باستخدام المواد السامة أو المستحضرات الصيدلانية ، والتي عادة ما يتم إذابتها في DMSO ثم يتم تخفيفها مباشرة في وسط ماء البيض.

يستخدم اللون الأزرق لأغراض عرض الفيديو أثناء العلاج الجنيني واليرقات. يمكن وضع اليرقات والأجنة في أطباق بتري عميقة بكثافة حوالي 50 إلى 60 يرقة لكل 50 ملليلتر حتى يغير التحليل السلوكي بعد سبعة أيام من الإخصاب محلول ماء البيض كل يومين على الأقل لتجنب نمو الفطريات أو البكتيريا من الأجنة الميتة. تم تصنيع القوالب البلاستيكية لإنشاء ممرات باستخدام aros ، والتي يتم سكبها في ألواح بلاستيكية بئر واحد من Thermos Scientific.

تحتوي القوالب على خمسة ممرات تكون فيها الجوانب بزاوية 60 درجة. انظر بروتوكول النص المصاحب لهذا الفيديو لمعرفة أبعاد القوالب والألواح؟ أولا ، قم بإعداد aros عن طريق إذابة 0.8٪ aros في الماء منزوع الأيونات مع 60 ملليغرام لكل لتر من المحيط الفوري.

بعد ذلك ، قم بإنشاء الممرات عن طريق صب 50 مل من الأروس المذاب في صفيحة بئر واحدة. ثم ضع القالب ببطء شديد فوق السائل الذي يقضي على أي تكوين فقاعة. قم بإزالة القالب عندما يبرد الأروس.

يمكن تخزين ممرات aros في درجة حرارة الغرفة مع الأغطية على الأطباق لمدة تصل إلى 36 ساعة. للتحليل السلوكي عالي الإنتاجية ، يتم إعداد خزانات التصوير بكاميرا رقمية بدقة 15 ميجابكسل متصلة بالجزء العلوي من الخزانة المواجهة لأسفل في الجزء السفلي من الخزانة. يتم وضع كمبيوتر محمول بشاشة مقاس 15.6 بوصة بحيث تكون الشاشة متجهة لأعلى.

لتجنب ارتفاع درجة حرارة اليرقات ، من الأفضل استخدام جهاز كمبيوتر محمول بدرجة حرارة شاشة لا تزيد عن 28 درجة مئوية. ضع موزعا بلاستيكيا أعلى شاشة الكمبيوتر المحمول التي ستوضع عليها لوحات agros. سيمنع الناشر المزيد من الأنماط في الصور التي تم جمعها.

لبدء التقاط الصورة ، انقل اليرقات بعناية من طبق بتري إلى حارة agros للمساعدة في تقليل إجهاد اليرقات. يمكن وضع ما يصل إلى 20 يرقة في كل حارة ، ولكن عادة ما تستخدم خمس يرقات في كل حارة لتسهيل التتبع الأكثر دقة لسرعة السباحة وتقليل عدد اليرقات اللازمة لكل تجربة ، املأ الممرات بماء البيض ، مع أو بدون الأدوية أو المواد السامة اعتمادا على التجربة. لا تملأ الممرات بالكامل حتى يتم وضعها في خزانات التصوير لمنع الفائض.

اترك 10 دقائق حتى تتأقلم اليرقات بعد فترة التأقلم. ضع أربع لوحات يدويا مباشرة أعلى شاشة الكمبيوتر المحمول. في هذا الوقت ، يمكن تغطية الممرات بالبيض أو الماء أو المعالجة الكيميائية بحيث تكون مستوية مع الجزء العلوي من الممر للتخلص من الظلال على حواف الممرات.

في الصور ، قم ببرمجة الكمبيوتر للتصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني ، والتقاط الصور كل ست ثوان ليصبح المجموع 300 صورة لكل تجربة. اضبط الكاميرا على دقة أقل للتصوير بسرعة الفيديو. بينما تحد الدقة المنخفضة من التسجيلات إلى لوحة واحدة متعددة الآبار.

تسجيلات الفيديو مناسبة لتصوير أحداث السباحة السريعة. استخدم عرض PowerPoint التقديمي كمحفز مكروء لليرقات في هذا العرض التوضيحي. يبدأ PowerPoint بخلفية بيضاء فارغة لمدة 15 دقيقة ، متبوعة ب 15 من شريط أحمر متحرك في النصف العلوي من اللوحة.

لتجنب تبخر السائل داخل ممرات aros ، حافظ على الحد الأقصى لوقت التصوير أقل من ساعة واحدة. افتح الصور التي تحتوي على الصورة J في هذا العرض التوضيحي. يتم استخدام ماكرو داخلي لتحليل اليرقات ذات الخمسة حارات ويمكن إتاحته لأي مستخدم.

استخدم المطالبات الموجودة في الماكرو لتعيين المعلمات، مثل عدد الصور واللون المراد طرحها. ثم يقوم الماكرو تلقائيا بتقسيم قناة اللون بحيث يمكن إزالة اللون الأحمر. يطرح الخلفية ويطبق عتبة ويحدد اليرقات عن طريق تحليل الجسيمات.

بعد تشغيل جميع الصور من خلال الصورة J Macro ، سيتم عرض ملف النتائج وسيحتوي على إحداثيات XY لليرقات الفردية لكل صورة ، جنبا إلى جنب مع رقم الصورة ورقم المسار. احفظ ملف النتائج بتنسيق Excel وفرزها بناء على خلفية فارغة مقابل خلفية الشريط المتحرك ، ثم رقم البئر. استخدم قالب Excel يحتوي على معادلات مضمنة لتحديد موضع اليرقات تلقائيا في مسافة الآبار بين اليرقات وسرعة الحركة ومقدار الراحة.

أحدث قالب Excel تم إنشاؤه في مختبر Cretin عند الطلب لبناء الرسوم البيانية التي تعرض مجموعات العلاج المختلفة في ورقة Excel ، جنبا إلى جنب مع اختبار T للمقارنة بين مجموعات العلاج والضوابط. يمكن إجراء المزيد من التحليل الإحصائي باستخدام برنامج SPSS الإحصائي. تظهر النتائج بالنسبة لليرقات المعالجة بماء البيض و DMSO كضوابط وتركيزات متفاوتة من مبيد آفات الفوسفات العضوي الموجود بشكل شائع في الأطعمة غير العضوية.

تظهر الأشرطة البيضاء هنا بيانات من اليرقات المعرضة لخلفية فارغة ، وتظهر الأشرطة الحمراء بيانات من اليرقات المعرضة للشريط المتحرك الأحمر. تحكم. تظهر اليرقات المزروعة في ماء البيض تفضيلا متزايدا لتكون في الطبق بعد تقديمها مع الشريط الأحمر المتحرك. يتم الحصول على نتائج مماثلة عندما تزرع اليرقات في ماء البيض تحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر من DMSO ، وهو مذيب يستخدم بشكل شائع لإذابة العديد من الأدوية والمواد السامة كمحلول مخزون 1000 ×.

تشير الرسوم البيانية إلى القياسات التي يمكن الحصول عليها من التحليل السلوكي ، بما في ذلك النسبة المئوية لليرقات في الممر ، والنسبة المئوية لليرقات في نهاية الممر ، والنسبة المئوية لليرقات على حافة الممر ، والمسافة بين سرعة سباحة الأسماك لليرقات ، والنسبة المئوية لليرقات في حالة راحة. النتائج المعروضة هي عينة من تجربة واحدة. ومع ذلك ، عند تكرارها ، تشير النتائج إلى أن سرعة السباحة وسلوك figma يتغيران بسبب تركيزات منخفضة من مبيدات الآفات الفوسفاتية العضوية ، والتي تحاكي المستويات في طعام الإنسان بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تحليل التصوير والتصوير في غضون ساعة ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أهم جانب في هذا الإجراء هو تذكر الحفاظ على نظافة الوسط الثقافي عن طريق استبداله بوسيط جديد يوميا.