عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في عزل عديد السكاريد الشحمي من السطح الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام، وتوصيف البنية التركيبية لجزء Lipid A باستخدام بروتوكولات مطيافية الكتلة الترادفية (tandem MS). ويتحقق ذلك من خلال الاستخلاص الكيميائي لعديد السكاريد الشحمي من سطح الخلية البكتيرية، يليه تحلل مائي حمضي خفيف لتحرير Lipid A من جزء عديد السكاريد في عديد السكاريد الشحمي. وفي خطوة ثانية، يتم تحليل محلول Lipid A بواسطة مطيافية الكتلة الترادفية بالتأين بالرش الإلكتروني (electrospray ionization MSMS).

في إجراءنا هذا، يتم تحليل ليبيد A (lipid A) باستخدام مطيافية الكتلة المتتالية (MS MS) القائمة إما على التفكك المستحث بالتصادم أو التفكك الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية لغرض التوصيف البنيوي. وتظهر النتائج اختلافات في نمط التجزئة في أطياف الكتلة الناتجة عن بروتوكولات MS MS القائمة على التفكك المستحث بالتصادم أو التفكك الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية، حيث يعطي التفكك الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية (UVPD) نمط تجزئة أكثر غزارة بالمعلومات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن مطيافية الكتلة المتتالية تسمح باستيضاح المواد التحليلية المستهدفة بناءً على تفسير أنماط التجزئة التشخيصية.

تعد الصور الفوتوغرافية فوق البنفسجية، وبالأخص التفكك الناجم عن الضوء فوق البنفسجي، طريقة MSMS عالية الطاقة تنتج أيونات شظايا أكثر تنوعاً من التقنيات الحالية مثل التفكك الناجم عن التصادم. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن طريقة مطيافية الكتلة UVPD المستخدمة لم يتم تسويقها تجارياً بعد. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم هذه الطريقة ليزراً تم دمجه مع مطياف الكتلة من خلال تعديل مخصص قبل البدء في هذا الإجراء.

قم بحصاد الخلايا من مزرعة بكتيرية بحجم 250 mil، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 10,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بسكب السائل الطافي من الوسط الغذائي، واغسل كتلة الخلايا المترسبة بـ 50 mil من 1X PBS. بعد إجراء عملية الطرد المركزي لإعادة ترسيب الخلايا، قم بسكب السائل الطافي.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخلايا في 40 ml من 1X PBS ووزعها على أنبوبي طرد مركزي من التفلون سعة 250 ml. أضف 25 ml من الكلوروفورم و 50 ml من الميثانول إلى كل أنبوب للحصول على خليط أحادي الطور. اخلط عن طريق القلب ثم حضّن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل.

لضمان التحلل الخلوي الكامل، قم بطرد الخليط مركزياً عند 2000 ×g لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتخلص من الطافي. اغسل راسب LPS بنحو 100 مل من خليط Bly dire أحادي الطور. قم بالطرد المركزي عند 2000 ×g لمدة 20 دقيقة وتخلص من الطافي.

أضف 27 ml من محلول منظم للتحلل المائي الحمضي الخفيف إلى كتلة LPS واملأ المزيج بواسطة السحب والدفع بالماصة حتى لا يتبقى سوى جزيئات صغيرة، ثم استخدم جهاز السونيكيشن بمسبار الطرف لضمان إعادة تعليق كتلة LPS في المحلول بشكل متجانس عند دورة عمل ثابتة لمدة 20 ثانية وبقدرة 50%. كرر عملية السونيكيشن للعينة مرتين، بحيث تستغرق كل دفعة 20 ثانية مع فاصل زمني يبلغ خمس ثوانٍ تقريباً بين الدفعات.

بعد ذلك، يتم غلي العينات في حمام مائي لمدة 30 minutes. تُزال الأنابيب من الحمام المائي وتُترك العينات لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. وقبل البدء في استخلاص lipid A بعد التحلل المائي، يتم تحويل محلول SDS إلى خليط BLY ثنائي الطور عن طريق إضافة 30 ml من الكلوروفورم و30 ml من الميثانول لتشكيل خليط من الكلوروفورم والميثانول ومحلول منظم للتحلل المائي الحمضي الخفيف، ثم يُمزج الخليط عن طريق القلب ويُوضع في جهاز الطرد المركزي.

يُفصل العينة S لمدة 10 دقائق عند 2000 ×g. وباستخدام ماصة زجاجية، يتم استخلاص الطور السفلي في أنبوب طرد مركزي نظيف من التفلون. بعد ذلك، يتم إجراء استخلاص ثانٍ عن طريق إضافة 30 ml من الطور السفلي لخليط ثنائي الطور متوازن مسبقاً إلى الطور العلوي في أنبوب العينة، ويُخلط بالقلب ثم يُفصل عند 2000 ×g لمدة 10 دقائق. يُستخلص الطور السفلي باستخدام ماصة زجاجية ويُجمع مع الطور السفلي الذي تم استخلاصه مسبقاً.

اغسل الأطوار السفلية المجمعة عن طريق إضافة 114 mil من طور bly dire العلوي الموازن مسبقاً لإنشاء خليط bly dire ثنائي الطور، ثم اخلطه عن طريق القلب وقم بالطرد المركزي. استخدم قوة 2000 ×g لمدة 10 دقائق باستخدام ماصة نقل زجاجية. انقل الطور السفلي إلى دورق مبخر دوار زجاجي نظيف وجفف العينة باستخدام التبخير الدوار.

بعد ذلك، أضف 5 mL من خليط الكلوروفورم والميثانول إلى الدورق الدوار، ثم ضعه في حمام سونيكي لمدة 30 ثانية على الأقل، وذلك للمساعدة في تعليق lipid A من جوانب الدورق. استخدم ماصة نقل زجاجية لنقل الدهون إلى أنبوب زجاجي نظيف محكم الإغلاق بسدادة فينولية مبطنة بـ A-P-T-F-E.

جفف العينة تحت تيار من النيتروجين باستخدام مجفف النيتروجين. ثم أعد تعليق الدهون المجففة في 1 mL من خليط الكلوروفورم والميثانول. بعد إضافة المذيب، قم برج الخليط باستخدام جهاز Vortex لضمان إعادة التعليق بشكل كامل.

انقل المادة إلى قارورة عينات زجاجية صغيرة وجففها باستخدام مجفف النيتروجين. تُحفظ العينة المجففة عند درجة حرارة -20 °C لحين إجراء تحليل TLC أو MS اللاحق. يمكن تخزين العينة عند درجة حرارة -20 °C حتى يتم تحليلها لاحقاً.

بمجرد تحضير العينة، اخلط 200 µL من الميثانول بدرجة HPLC مع 200 µL من الكلوروفورم بدرجة HPLC في قارورة عينات زجاجية صغيرة فارغة، ثم انقل 200 µL من خليط مذيب الكلوروفورم والميثانول إلى القارورة التي تحتوي على lipid A، وعالج محتويات القارورة بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق أو حتى تذوب جميع المواد. بعد ذلك، قم بضبط مطياف الكتلة على وضع التأين بالرش الإلكتروني السالب، ثم املأ محقنة سعة 250 µL بمحلول lipid A.

أدخل المحقنة في مضخة محاقن وقم بضخ الدهون المخففة مباشرة. يتم ضخ العينة بمعدل تدفق يتراوح من 2.0 إلى 3.5 µL في الدقيقة. قم بتحسين وتعزيز إشارة أيونات الدهون من خلال ضبط البصريات الأيونية.

قم بجمع طيف الكتلة للليبيد. قم بعزل النوع وتنشيط الليبيد A المستهدف عن طريق اختيار CID كطريقة لـ MSM. بعد ذلك، قم بزيادة جهد CID أو طاقة التصادم المعيارية حتى يتم تكسير الليبيد السلف.

تكون وفرة النوع النسبية حوالي 10% مقارنةً بأعلى أيون ناتج؛ قم باستحصال الأطياف وحساب متوسطها حتى يتم تحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية. وبالنسبة للأيونات الناتجة، قم بتحضير العينة ومطياف الكتلة كما هو موضح في القسم السابق. قم بتشغيل الليزر المتصل بمطياف الكتلة.

راجع البروتوكول النصي للحصول على تفاصيل MS، وقم بضبط برنامج الجهاز بحيث يحفز الليزر ليزر الإكسيمر (excimer laser) عند دخول الأيونات إلى خلية HCD؛ بعد ذلك، قم بتشغيل مولد النبضات بحيث يتم إرسال نبضات الليزر كل 2 milliseconds. قم بعزل أيون سلف الليبيد عن طريق اختيار HCD كمنهج MS MS، واضبط طاقة التصادم على 1% من طاقة التصادم المعيارية (normalized collision energy)؛ قم بتنشيط أيون الليبيد المعزول عن طريق زيادة طاقة الليزر وضبط عدد نبضات الليزر، والتي تكون عادةً عشر نبضات بقوة 6 mJ. وأخيراً، قم بالحصول على الأطياف وحساب متوسطها حتى يتم الوصول إلى نسبة إشارة إلى ضجيج كافية.

بالنسبة لأيونات نواتج UVPD. يُظهر طيف كتلة MALDI TOF للأيونات السالبة لـ lipid A المستخلص من سلالة E Coli K 12 W 3 110 نوعاً واحداً من الأنواع منزوعة البروتون عند نسبة كتلة إلى شحنة تبلغ 1796.2 كأبرز الأنواع الملحوظة. تتوفر تفاصيل تحليل maldi to ضمن البروتوكول النصي.

وبدلاً من ذلك، فإن عينة الليبيد نفسها عند إخضاعها لتقنية ESI في الوضع السالب تنتج بشكل أساسي أيونات ليبيد منزوعة البروتون مرتين عند نسبة شحنة رئيسية قدرها 898.1، كما يمكن ملاحظة أيونات ليبيد منزوعة البروتون عند نسبة شحنة رئيسية قدرها 1796.20، ولكن بوفرة نسبية أقل من الأنواع منزوعة البروتون مرتين. وقد أُجري التجزئة عن طريق CID أو UVPD عند 193 nanometers على أيون الليبيد منزوع البروتون المفرد. ويمكن استخدام هذه التقنيات لتحديد البنى الكيميائية بشكل أفضل، لا سيما بالنسبة لليبيدات.

نوع يحتوي على تركيبات معقدة من التعديلات أو تعديلات كيميائية لم يتم توصيفها سابقاً. يتم عرض ملفات التجزئة بخطوط متقطعة تمثل مواقع الانشطار، وهي متطابقة مع قيم نسبة الشحنة الرئيسية الموجودة أسفل كل بنية موضحة. تمثل قيم نسبة الشحنة الرئيسية ومواقع الانشطار المظللة باللون الأحمر أيونات ناتجة فريدة مرتبطة بالدهون الموصومة بـ UVPD 32 P.

تم تحليل lipid A المستخلص من سلالتين مختلفتين من E. coli K12 باستخدام تقنية TLC. تم تفصيل بروتوكول هذا الإجراء ضمن البروتوكول النصي. تحتوي سلالة K12 W3110 في الغالب على lipid A مفسفر بنوع BIS أو tris، أو يُلاحظ نمط TLC أكثر تعقيداً مع 32p lipid.

تم عزل A من سلالة e coli، WD 1 0 1. وتنتج سلالة WD 1 0 1 ليبيد معدلاً بشكل مكثف بواسطة rabino وphosphoethanolamine.

بما أن كل من الفوسفات في الموضع 1 و4' متاحان للتعديل، يمكن وصف ليبيد A (lipid A) المستخلص من WD 1 0 1 بأنه معدل بشكل فردي بحيث يحتوي على جزيء واحد فقط من el amino arabinose أو phosphoethanolamine عند أي من مجموعتي الفوسفات، أو معدل بشكل مزدوج حيث يتم تعديل كلتا مجموعتي الفوسفات بطريقة توافقية. وبالإضافة إلى التعديل عند الفوسفات في الموضع 1 و4'، لوحظ أيضاًتأثير إضافة Palmitate، مما يؤدي إلى زيادة قيمة RF لأنواع ليبيد A في نظام المذيب هذا. لقد مهد هذا البروتوكول الطريق بشكل فريد للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لمزيد من استكشاف العلاقات بين البنية والوظيفة فيما يتعلق بكيفية تأثير تعديلات ليبيد A على بيولوجيا البكتيريا سالبة الجرام.

نحن مهتمون للغاية أيضاً وقد أثبتنا قدرة مطيافية الكتلة القائمة على التفكك الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية (UVPD) على توصيف هياكل الجزيئات ذات الأهمية البيولوجية، مثل الجليكانات والبروتينات والأحماض النووية والليبيدات المعقدة الأخرى. لا تنسَ أن العمل مع المذيبات العضوية والمواد ذات الخطورة البيولوجية والليزر يمكن أن يكون خطيراً للغاية. ومن المهم التأكيد على ضرورة التعامل مع المذيبات داخل غطاء fume hoods الكيميائي المجهز بنظام تهوية.

يجب دائماً ارتداء معدات الوقاية المناسبة مثل القفازات والنظارات الواقية، كما يجب عزل الليزر المستخدم في عملية UVPD بشكل صحيح.