بروتوكول لالتعريفي الجيني والتخيل من أورام حميدة والغازية في رأسي مجامع ذبابة الفاكهة السوداء البطن

الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث أورام حميدة وغازية في ذبابة الفاكهة ، ثم تصورها عن طريق تشريح مركب اليرقات الرأسية. يبدأ هذا بالإعداد بين السلالات المرغوبة وعزل ذرية اليرقات ، التي تحمل الأورام الغازية أو الحميدة. الخطوة التالية هي تشريح اليرقات المختارة.

لفضح المركب الرأسي عن طريق قطعها أولا ثلثي الطريق لأسفل ، وتثبيتها ، ثم قلبها من الداخل إلى الخارج. بعد ذلك يتم تنظيف أنسجة الجسم والأمعاء الدهنية ، ثم يتم أيضا كسر أي أعصاب لا تزال متصلة بالحبل العصبي البطني وبشرة اليرقات. الخطوة الأخيرة هي تصوير المركب الرأسي أو إصلاحه للتطبيقات النهائية.

في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج أورام غازية أو حميدة موسومة GFP من خلال استخدام الفحص المجهري الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا السرطان. على سبيل المثال، قد ترغب في فهم الجينات التي يمكن أن تمنع تطور الأورام في كائن حي سليم.

بمجرد الحصول على المخزونات الجينية المطلوبة ، قم بإعداد ثقافة بداية لسلالة المختبر. قم أيضا بإعداد ثقافة بداية للمخزون المختبر. اعبر 10 عذارى من مخزون الاختبار مع 10 ذكور من المخزون المختبر.

اسمح للذباب بالتزاوج ووضع البيض لمدة 24 إلى 48 ساعة عند 25 درجة مئوية ، ثم انقلها إلى قارورة جديدة لإنتاج المزيد من النسل. راقب القوارير المتقاطعة بحثا عن البيض ويرقات الطور الأول. قم بإعداد صليب جديد.

إذا أظهرت القوارير التي تم جمعها ترسب بيض ضعيف. إذا بدأت القوارير التي تم جمعها في الجفاف ، أضف ثلاث إلى أربع قطرات فقط من الماء المقطر بالأوتوكلاف للحفاظ على رطوبة المزرعة. استمر في مراقبة القوارير حتى التجول.

يرقات الطور الثالث موجودة. ثم تابع مراقبتها تحت مجهر ستيريو فلوري. باستخدام نفس الإجراء ، اجمع الذباب الذي يحمل أورام غازية باستخدام المخزونات المدرجة بحلول اليوم الخامس أو السادس للزراعة ، ستتوفر يرقات الطور الثالث المتجولة من مزارع الورم الحميدة.

ومع ذلك ، لن تكون متاحة حتى اليوم 10 من مزارع الأورام الغازية. لجمع يرقات الطور الثالث ، بلل فرشاة الرسم الناعمة بالماء المقطر واكشطها من جدار القارورة. ضع اليرقات في شريحة اكتئاب مع XPBS بارد ، ثم باستخدام فرشاة طلاء مبللة.

اكشط أي مادة غذائية من بشرتها. لبضع دقائق من الشلل ، ضع اليرقة على الطبق عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة. لفترة أطول من الشلل ، ضع اليرقات في قارورة استزراع مع قيلولة ذبابة فقط على عصا.

قم بتوصيل قارورة الثقافة واتركها لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك ، انقل اليرقات المجمدة إلى شريحة زجاجية. أضف قطرة من زيت الهالة الخفيف الكربوهيدرات وقم بتغطية اليرقات بغطاء زجاجي.

الآن ، راقب اليرقات تحت مجهر ستيريو فلورسنت. لتعبير GFP ، حدد يرقات الفلورسنت الخضراء وتابع التشريح. سوف تتألق اليرقات الحميدة الحاملة للورم باللون الأخضر في المنطقة الأمامية حيث يوجد المركب الرأسي.

سوف تتألق الأورام الغازية أيضا باللون الأخضر في المنطقة الأمامية من اليرقات في المركب الرأسي. إذا أمكن ، تأكد من توثيق أورام التألق بالصورة. لذا فإن البشرة الشفافة لليرقة تجعل من الصعب ملاحظة مدى هجرة الأورام ، ولهذا السبب يجب علينا تشريح الأورام.

ابدأ باستخدام الملقط لنقل يرقة جديدة مع أي من الورم. اكتب في بئر من طبق تشريح يحتوي على ملليلتر واحد من XPBS بارد. أمسك اليرقات لأسفل باستخدام زوج من الملقط على بعد حوالي ثلثي المسافة من الطرف الأمامي.

باستخدام زوج آخر من الملقط ، افصل بذكاء الثلث الخلفي من اليرقات وتخلص منه. ثم تركت الثلثين الأماميين. عندما يتم إطلاق الضغط داخل اليرقات ، سوف تتسرب محتوياتها من تجويف الجسم.

باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأنسجة التي خرجت من تجويف الجسم. بعد ذلك ، أمسك خطاف فم اليرقة وادفعه إلى اليرقة البشرة. باستخدام الزوج الآخر من الملقط ، قم بعكس اليرقات تماما.

الآن باستخدام الملقط ، بلطف وحذر ، قم بإزالة الغدد اللعابية الدهنية في الجسم والأمعاء ومركب قرص الجناح وأي أنابيب قصبة هوائية. قد يكون المركب الرأسي مرئيا الآن متصلا بخطاف الفم. لا يزال نصفي الكرة المخية و VNC متصلين ببشرة اليرقات عبر الأعصاب المنبعثة من VNC.

باستخدام ملقط ، قم بكسر هذه الوصلات برفق. ثم قم بإزالة أي دهون زائدة في الجسم أو أنسجة أخرى بحيث يصبح المركب الرأسي مرئيا بوضوح. تعلق على بشرة اليرقات في خطافات الفم.

اترك المركب الرأسي كما هو لمزيد من المعالجة قبل التصور. خلاف ذلك ، لتصور المركب الرأسي مباشرة ، افصله عن البشرة وضعه في قطرة من وسائط التثبيت القائمة على الجلسرين مثل درع المتجه. باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم إحداث أورام في العين.

انين القرص ، ظلت الأورام الحميدة موضعية في قرص العين حيث يتم تحريضها. لاحظ أن الأنسجة المسماة GFP لم تهاجر إلى أعضاء متجاورة مثل الحبل العصبي البطني في المركب الرأسي الذي يحمل أورام غازية من يوم 10 لوحظ فرط نمو اليرقات في أنسجة الورم. أيضا ، كما هو موضح في السهم الأحمر ، غزت الأورام الأعضاء المتجاورة مثل VNC وخطافات الفم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إحداث الأورام الحميدة والغازية وراثيا ، ثم تصورها عن طريق تشريح المركب الرأسي داخل المعدة الرأسية.