إنشاء نظام في المختبر لدراسة السلوك داخل الخلايا للمبيضات الجلابراتا في البلاعم THP-1 البشرية

يكمن الهدف العام من هذا الإجراء في إنشاء نظام نموذج زراعة مخبرية لدراسة السلوك داخل الخلوي لممرض فطري انتهازي بشري، وهو *Candida labratta* في البلاعم المشتقة من الخط الخلوي الوحيدي البشري THP-1. ولتحقيق ذلك، تُعالج خلايا THP-1 الوحيدية أولاً باستخدام PMA لتفاضلها إلى بلاعم.

بعد ذلك، يتم إصابة البلاعم من نوع THP-1 بخلايا candida GTA. وبعد ساعتين من الإصابة، تُزال خلايا candida GTA غير المبلعمة عن طريق الغسل بمحلول PBS، ثم تُستعاد الخلايا داخل الخلوية لإجراء المزيد من الدراسات عبر تحليل البلاعم المصابة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم كل من نسبة الفيروس إلى خلايا candida GTA في البلاعم، بالإضافة إلى تقييم نضوج الجسيمات البلعمية والاستجابة السيتوكينية في بلاعم THP-1 عند الإصابة بـ candida GTA.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لفحص مكتبة طفرات candida collaborator للكشف عن التغيرات في أنماط البقاء على قيد الحياة في الخلايا البلعمية TSP one بطريقة شبه عالية الإنتاجية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه غير مكلف نسبيًا، وقابل للتكرار بدرجة عالية، وسهل التكييف مع الخلايا المناعية المختلفة وكذلك المسببات المرضية الفطرية. لبدء الإجراء، وقبل يومين من العدوى، يتم إيصال خلايا THP والأرومات الوحيدية إلى 80%CO، وفي اليوم الأول، يتم إخراج وعاء المزرعة وببطء ورفق تعليق جميع الخلايا في المحلول.

انقل معلق خلايا THP-1 monocyte إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ml. قم بطرد معلق الخلايا مركزياً في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق بسرعة 1000 RPM. اسكب الوسط في حاوية نفايات، ثم أضف 5 ml من وسط RPMI إلى الأنبوب وأعد تعليقه. قم بتعليق كتلة خلايا THP-1 عن طريق سحب الوسط بلطف باستخدام الماصة من ثلاث إلى أربع مرات.

خذ 10 µL من معلق الخلايا لتحديد كثافة الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم اضبط كثافة الخلايا لتصبح 1 مليون خلية لكل ml. أضف 1 µL من محلول PMA المخزن بتركيز 60 µM إلى معلق الخلايا بحيث يكون التركيز النهائي 16 nM، واخلطه جيداً. وزع 1 ml من معلق الخلايا بما يعادل مليون خلية في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الـ 24 بئراً، وانقلها إلى حاضنة مضبوطة عند 37 °C و 5% CO2.

بعد 12 ساعة من الحضن، تخلص من الوسط القديم. أضف 1 ml من وسط pre RPI إلى كل بئر واحضن الطبق لمدة 12 ساعة أخرى. ستُستخدم هذه الخلايا في عدوى Canada atory، والتي سيتم عرضها لاحقاً.

باستخدام الممارسات الميكروبيولوجية السليمة، يتم تلقيح مستعمرة واحدة من EA في دورق يحتوي على 1 mL من وسط YPD. تُحضن الدوارق لمدة تتراوح من 14 إلى 16 ساعة في حاضنة مضبوطة عند 30 Degrees Celsius، وبعد انتهاء فترة التحضين، يتم طرد 1 mL من المزرعة مركزياً بسرعة 4,000 RPM لمدة خمس دقائق.

تخلص من السائل الطافي واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول PBS المعقم. بعد التخلص من محلول الغسيل، قم بتعليق كتلة الخلايا في 1 ml من محلول PBS المعقم عن طريق الماصة برفق. بعد ذلك، قم بقياس امتصاصية معلق الخلايا في مقياس الطيف الضوئي عند 600 nanometer واضبط كثافة الخلايا لتصل إلى 2 مليون خلية لكل ml باستخدام محلول PBS.

خذ 50 µL من معلق الخلايا وقم بتخفيفه بمقدار مائة ضعف في PBS، ثم انشر 100 µL من المزرعة على وسط YPD AGA. قم بحضن الطبق عند 30 °C وعدّ عدد المستعمرات التي ظهرت على طبق YPD بعد يوم أو يومين، ثم اضرب هذا العدد في عامل التخفيف المناسب لحساب وحدات تكوين المستعمرات عند الساعة صفر. وسيتم استخدام هذا العدد من وحدات تكوين المستعمرات من Canada Reta لإصابة DHE في الخلايا البلعمية.

في الخطوة التالية، أضف 50 µL من معلق خلايا Canada clater إلى طبقة أحادية من الخلايا البلعمية (macrophage) في طبق زراعة ذو 24 بئراً. هز الطبق لتوزيع الخلايا بالتساوي، ثم قم بالتحضين عند 37 °C. بعد تحضين لمدة ساعتين، تخلص من الوسط عن طريق قلب طبق الزراعة في وعاء، ثم أضف إلى كل بئر من أبار طبق الزراعة 1 ml من محلول PBS العازل بعناية على طول جانب البئر، اغسل الأبار جيداً ثم تخلص من المحلول العازل.

كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين. بعد ذلك، وباستثناء البئر الأولى، أضف 1 mL من وسط RPI إلى جميع الآبار الأخرى، والتي يمكن استخدامها لمراقبة التكاثر داخل الخلايا لخلايا candida atory في الساعات 4 و6 و12 و24 بعد العدوى. ولاستعادة الخلايا داخل الخلوية بعد ساعتين من إصابة الخلايا البلعمية، أضف 1 mL من sterile water إلى البئر. بعد دقيقتين، اكشط البئر برفق باستخدام طرف ماصة 1 mL لإزالة حطام الخلايا البلعمية من البئر.

اشطف البئر واجمع المحلل في أنبوب سنترفيوج ماكرو. حضر تخفيفاً بمقدار مائة ضعف لمحلل خلايا microFIT في PBS وازرع 100 µL على وسط YPD AGA. حضن الطبق عند 30 °C لمدة تتراوح من يوم إلى يومين واحسب عدد الوحدات المكونة للمستعمرات.

اضرب هذا الرقم في عامل التخفيف المناسب لحساب عدد خلايا *Candida auris* التي قامت خلايا T2 والبلاعم ببلعمتها بعد ساعتين من العدوى. وبالمثل، يمكن تحديد عدد خلايا *Candida auris* الموجودة داخل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. ويمكن تمثيل مرحلة ما بعد العدوى والتضاعف داخل الخلايا كزيادة في وحدات تكوين المستعمرات (CFUs) عند 24 ساعة مقارنة بوحدات تكوين المستعمرات التي تم استيعابها داخلياً في غضون ساعتين كما هو موضح هنا.

نتائج أخرى لتجربة نموذجية حيث كان العدد الإجمالي لخلايا canida gator المصابة بخلايا TV one البلعمية هو 6 × 10². وكان عدد الخلايا المستعادة بعد 24 ساعة هو 3.76 × 10⁴. وهذا يوضح أن الخلايا يتم بلعمتها بمعدل 62.66% خلال فترة الحضانة المشتركة التي استمرت 24 ساعة.

أظهرت الخلايا تضاعفاً بمقدار 5.2 مرة مع زيادة عدد الخلايا e داخل الخلوية من 3.76 times 10.4 إلى 1.96 times 10.5. في هذه التجربة، يمكن أيضاً تقييم التضاعف داخل الخلوي لخلايا canida TER باستخدام خلايا E المعبرة عن GFP مع استخدام المجهر البؤري لهذا الغرض. قم بتحضير وإصابة THV والبلعميات في شريحة ذات أربع غرف باستخدام البروتوكول الموصوف سابقاً لطبق الزرع ذو الـ 24 بئراً.

بعد ساعتين من العدوى. تخلص من الوسط عن طريق قلب الشريحة في حاوية نفايات، ثم أضف 500 µL من PBS إلى كل حجرة في الشريحة. اشطف جيداً وتخلص من PBS.

كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين باستخدام 500 µL من الفورمالدهيد بتركيز 3.7% لتثبيت الخلايا. حضّن الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم تخلص من الفورمالدهيد. اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام 500 µL من PBS لنفاذ الخلايا البلعمية باستخدام 500 µL من Triton X، وبعد تحضين لمدة خمس دقائق، قم بإزالة Triton X واغسل البئر ثلاث مرات باستخدام PBS.

قم بتفكيك شريحة الغرفة بعناية باستخدام أداة إزالة الغرفة وشريحة راكبة للهواء. ضع قطرة واحدة من وسط التثبيت Vector Shield الذي يحتوي على DPI على كل قطاع من قطاعات الشريحة، ثم ثبّت غطاء الشريحة وأغلق الحواف بطلاء الأظافر، وعاين الخلايا باستخدام مجهر كونفوكال. تظهر هنا صور كونفوكال تمثيلية لخلايا البلعمة TP1 المصابة بخلايا Canida laboratory من النوع البري التي تعبر عن GFE؛ حيث يشير الارتفاع بمقدار ستة أضعاف تقريبًا في عدد خلايا e داخل الخلايا من ساعتين إلى 24 ساعة إلى تضاعف Canida laboratory في خلايا البلعمة TP1. يُستخدم نهج طفرات علامة التوقيع (signature tag mutagenesis) على نطاق واسع لتحديد عوامل الضراوة في المسببات المرضية الميكروبية، حيث يتم فحص عدد كبير من الطفرات في آن واحد للكشف عن عيوب النمو عبر تسلسل قليلة النيوكليوتيد الفريد للعلامة.

نصف هنا بروتوكولنا الخاص بمسح STM لمكتبة كندا والمكتبة الطافرة، والذي يتكون من الخطوات الثلاث التالية. أولاً، يتم تثبيت 96 بلازميد، يحمل كل منها مجموعة تسلسلات قليلة النوكليوتيد فريدة، على غشاء نايلون.

في الخطوة الثانية، يتم فحص مجموعة من 96 طفرة من فطر *Candida albicans* للكشف عن تغيرات في أنماط البقاء داخل الخلايا البلعمية من نوع THP-1، يتبع ذلك استعادة الخلايا الطافرة النامية والمستدمجة داخل الخلايا البلعمية من وسط YPD، والتي سيُشار إليها بعينات المدخلات والمخرجات على التوالي. وأخيراً، يتم تضخيم علامات البصمة الحمضية (DNA signature tags) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ووسمها إشعاعياً من عينات الحمض النووي الجينومي للمدخلات والمخرجات. ثم يتم تهجين ناتج تفاعل PCR مع علامات فريدة، وتُقاس الإشارات المشعة على الغشاء وتُحلل.

لتجميع جهاز لوحة الـ 96 12 نقطة، ضع غشاء نايلون رطباً فوق ورق شجر الرياح المبلل وقم بربط براغي الوحدة. اغسل الغشاء بماء معقم، يليه غسل باستخدام 0.4 mu sodium hydroxide. انقل 200 nanogram من محلول PLA BDNA من كتلة 96 12 إلى الآبار المقابلة في جهاز dot blood apptus بعد إجراء غسل بـ 0.4 molar sodium Hydroxide.

أخرج الغشاء من جهاز بقع الدم بعد فترة تداخل في XXSC متقاطعين، مع تثبيت BDNA البلازمي المنقول على الغشاء باستخدام جهاز الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية (UV crosslinker). قم بحضن الأغشية في محلول منظم ما قبل التهجين (pre-hybridization buffer) الخاص بـ input و UNE في زجاجات لمدة ساعتين عند 42 °C. قم بتحضير مجسات مشعة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام DNA جينومي مستخلص من كتل خلايا input و output، وبادئات ضد المنطقة المحيطة بالمقلوب (invert flanking region) للعلامات الفريدة (unique Tags).

قم بمسخ مسابير الوسم الإشعاعي عند 99 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم بردها سريعاً على الثلج. انقل المسابير إلى زجاجات الإدخال والإخراج وحضنها لمدة تتراوح من 14 إلى 16 ساعة عند 42 درجة مئوية. ما بعد التهجين.

اغسل أغشية الإدخال والإخراج كما هو موضح في البروتوكول. أخرج الأغشية من الزجاجات واتركها تجف في الهواء ثم عرضها لشاشة تصوير الفسفور. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات، قم بمسح شاشة الفسفور والحصول على الصور.

يظهر في هذا المثال مرشحان غشائيان مهجنان، يمثلان عملية فحص لمجموعة واحدة مكونة من 96 طفرة من canida Gatory للكشف عن تغير في البقاء. وفي عملية تقدير كمية الخلايا البلعمية وتحديد نسبة شدة الإشارة لكل بقعة في الغشاء الناتج مقارنة بالغشاء المدخل، تبيّن أن الأرقام التعريفية 13 و26 و75 و85 ممثلة بنسبة أقل في الناتج. هذه البقع محاطة بدوائر حمراء وتعكس نمو أربع طفرات مختلفة.

في المقابل، فإن الطفرات المتراكمة ذات التسلسلات الفريدة 11 و81 المظللة باللون الأخضر ممثلة بشكل مفرط في العينة الناتجة. بعبارة أخرى، من هذا الفحص لمجموعة مكونة من 96 طفرة، من المفترض أن تزيد طفرتان من فرص البقاء، بينما تظهر أربع طفرات نمواً في البلاعم. كما يجب التحقق من أنماط البقاء المتغيرة المحددة في فحص المجموعة هذا من خلال مقايسات العدوى الفردية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نظام فموي في المختبر (in vitro) لدراسة ملف النمو الداخلي للممرض الفطري الذي يهمك. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون قادراً الآن على إجراء فحص واسع النطاق لمجموعة من الطفرات باستخدام هذا النظام.