جيل والكميات 3-الأبعاد من الآفات الشرياني في الفئران عن طريق الإسقاط الضوئي المقطعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية استخدام التصوير المقطعي البصري للتصور والقياس الكمي ثلاثي الأبعاد لآفات تصلب الشرايين والنيوتيمال في الفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد آفات شريانية أولا في الفئران ، إما جراحيا أو عن طريق إطعام الفئران ذات الاستعداد للإصابة بتصلب الشرايين. الخطوة التالية هي عزل الشريان المستهدف وفحصه باستخدام التصوير المقطعي البصري.

الخطوات النهائية هي إجراء إعادة بناء الصورة وتحديد الآفة وقياس حجم الآفة. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج عمليات إعادة بناء تشريحية للآفة وقياس حجم الآفة وتضيق الشرايين من خلال تحليل الصور. تهتم مجموعتنا بفهم الآليات الكامنة وراء تكوين الآفات التي تسبب تضيق الشرايين مما يؤدي إلى مضاعفات تهدد الحياة مثل النوبات القلبية والسكتة الدماغية.

تم تطوير هذا التطبيق للتصوير المقطعي البصري في مجموعتنا من قبل الدكتور نيكولاس كيركبي ، بالعمل مع الدكتورة لوسي لوي ، وسيتم توضيحه من قبل الدكتور جونغ شي وو ، وهو عالم ما بعد الدكتوراه يعمل في مختبراتنا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل علم الأنسجة والكيمياء المناعية ، هي أنها أقل كثافة في العمالة وتسمح بالتحليل ثلاثي الأبعاد بدلا من التحليل ثنائي الأبعاد. يتم تعديل هذه التقنية للحث على آفات الشريان الفخذي من تلك التي قامت بها R and Company و Sada and Company.

يشرح بروتوكول النص كيفية إحداث آفات تصلب الشرايين عن طريق التلاعب بالنظام. ابدأ بفأر أسود C 57 يبلغ من العمر 10 إلى 12 أسبوعا ويزن ما بين 25 و 30 جراما. بمجرد التخدير ، ضع الماوس على وسادة دافئة للحفاظ على درجة حرارة جسمه وتوفير الفلور بنسبة اثنين إلى 3٪ عبر مخروط الأنف.

عندما لا يستجيب الفأر لقرص إصبع القدم ، قم بإعطاء البوبرينورفين بمعدل 0.1 ملليغرام لكل كيلوغرام. بعد ذلك ، ضع الفأر على ظهره واحلق السطح البطني للطرف الخلفي الأيسر. ثم قم بعمل شق لكشف عضلات الطرف الخلفي العلوي بين تشعب الشريان المأبضي وجدار البطن.

قم بإجراء تشريح حاد لعزل العصب الفخذي عن الشريان والوريد الفخذي طوال العملية. حافظ على رطوبة الأنسجة بنسبة 1٪ من حيث الحجم لي. بعد ذلك ، ضع أربطة حريرية مؤقتة 6.0 Mers حول الشريان الفخذي والوريد بالقرب من جدار البطن وأسفل الفرع مباشرة مع الشريان المأبضي.

هذه للتحكم في تدفق الدم. ثم عزل الشريان المأبضي ، من ملليمترين إلى خمسة ملليمترات بعيدا عن الفرع مع الشريان الفخذي ، وربط الشريان المأبضي تحت الشريان المأبضي. ضع رباط ثان.

الآن ، قم بعمل شق صغير لإدخال السلك في الشريان المأبضي على الفور بعيدا عن الفرع مع الشريان الفخذي. اضغط على الرباط المؤقت القريب لمنع النزيف من خلال الشق وفي الشريان الفخذي باتجاه جدار البطن. أدخل سلك G مقاس 0.014 بوصة بطول واحد إلى 1.5 سم.

اتركه في مكانه لمدة 30 ثانية ثم قم بإزالته. ثم باستخدام الأربطة ، قم بربط الشريان المأبضي فوق الشق. احرص على تجنب انسداد الشريان الفخذي.

الآن قم بإزالة الأربطة المؤقتة. أغلق الجرح بخيوط تشغيل متقطعة باستخدام 5.0 mercal. ثم ضع كريم EMLA.

اسمح للحيوان باستعادة وعيه وحركته في قفص الاسترداد قبل إعادته إلى قفص المنزل. من المتوقع أن تظهر الساق عرجا لمدة يومين أو ثلاثة أيام ، لكن هذا لا يعني أنه يجب عزل الفأر. بالنسبة للأرض الفلسطينية المحتلة ، يجب القتل الرحيم للفأر ، والحث على التخدير النهائي من البنتوباربيتال.

ثم قم بتثبيت التروية القلبية العابرة مع الاستئصال. الآن عزل الشرايين الفخذية أو قوس الأبهر وفروعه. قم بإزالة أي مادة محيطية غريبة في هذه العملية.

ثم بعد تثبيت الأنسجة في الفورمالين المحايد 10٪ طوال الليل. في اليوم التالي ، قم إما بتخزين الأنسجة في 70٪ من الإيثانول أو المضي قدما في تضمين الشرايين في 1.5٪ LMP aeros المفلترة. اخفض الأنسجة برفق في الأقواء المنصهرة عند حوالي 40 درجة مئوية.

تقليم الأيروس لعمل شكل مخروطي. الآن قم بتجفيف هذا المستحضر في 100٪ من الميثانول لمدة 12 ساعة على الأقل. بمجرد الجفاف ، قم بتنظيف الأوعية في خليط واحد إلى اثنين من الكحول البنزو والبنزوات بنزوات.

دع الأوعية تحتضن في هذا المحلول لمدة 12 إلى 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتحميل العينة التي تم تطهيرها في التصوير المقطعي ، والذي يجب معايرته مسبقا. تم تعيين القرار عند 1024.

بمقدار 1024 بكسل. اضبط التكبير لمنطقة الاهتمام. سيتم ضبط المحور Z تلقائيا على نفس الدقة.

سيكون حجم الفوكسل حوالي 200 ميكرون. بعد ذلك، باستخدام قناة Brightfield، ضع العينة بحيث تدور حول محورها في مركز مجال الرؤية. باستخدام قناة انبعاث مرشح GFP ، اضبط التركيز واضبط التعريض الضوئي لزيادة النطاق الديناميكي للصورة.

تجنب التشبع الزائد. الآن امسح السفينة في قناة انبعاث GFP واحدة فقط بخطوات 0.9 درجة. يجب بعد ذلك إعادة العينات إلى 100٪ من الميثانول لمدة 24 ساعة على الأقل قبل تضمينها في الشمع.

للتحليل النسيجي ، افتح الصور المكتسبة في برنامج n recon أو برامج مماثلة باستخدام برنامج عارض البيانات. تحقق من جودة إعادة بناء الصورة ، وقم بتحسين جودة الصورة ، واضبط شدة الصورة ، واجعل البرنامج يعوض عن أي محاذاة خاطئة للعينة من محور الدوران المثالي. لكل فحص، حدد المنطقة الرأسية التي تحتوي على الآفة.

في كل خط مسح 50 ، تتبع الحدود بين الوسائط وموضع الصفيحة المرنة الداخلية. يمكن للبرنامج بعد ذلك استيفاء الحدود في جميع عمليات الفحص الأخرى ، والتحقق يدويا من هذه الاستيفاء وتصحيحها حسب الحاجة. الآن قم بإنتاج صورة ثنائية مجموعة مع وحدات البكسل البيضاء التي تمثل neointima والبكسل الأسود التي تمثل تجويف براءة الاختراع.

يتم تحقيق ذلك من خلال تحديد عتبات الشدة. بمجرد تحقيق ذلك ، يكون حجم الجسم هو الحجم الكلي للآفة ، والحجم اللمعي هو الحجم الكلي ، مخصوما منه حجم الجسم. وبالتالي ، يتم تقييم توزيع الآفة والتجويف على طول الطول المحوري.

تم حصاد شرايين الفخذ الفئرانية بعد 28 يوما من الإصابة الناجمة عن الأسلاك أو الربط. كان سماكة النيو انتيمال واضحا في إسقاطات الانبعاث في الشرائح ثنائية الأبعاد المعاد بناؤها. يمكن تمييز الآفات الحزية حديثة المركز متحدة المركز.

حددت صور انبعاث التصوير المقطعي البصري للإسقاط لقوس الأبهر الكامل من فأر يعاني من نقص APOE الآفات المتوقعة في الانحناء الأصغر للقوس الأبهري ، والشريان العضدي الرأسي ، وفي أصول الشرايين السباتية وتحت الترقوة. تم تقسيم نفس الآفة وتقديمها باللون الأحمر. للتأكيد على توزيع اللويحات عند تركيبها على الصورة الأصلية ، يمكن تمييز الوسائط والتجويف في صور مقطعية توضح أن هذه كانت آفات غريبة الأطوار.

هنا ، عندما يتحرك الفحص بعيدا على طول هذه الفروع ، تقل الآفات تدريجيا وتختفي أولا في الشريان تحت الترقوة ، ثم في الشريان السباتي ، وأخيرا في الشريان العضدي. ومن المثير للاهتمام أن هذه الآفة في الشريان العضدي الرأسي تنتقل إلى مقسم التدفق حيث ينقسم هذا الوعاء إلى الشرايين السباتية اليمنى والشرايين تحت الترقوة اليمنى. بعد إجراء OPT ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم الأنسجة والكيمياء المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هو تكوين الآفة؟

لذلك بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للعلماء العاملين في مجال أبحاث الأوعية الدموية للتحقيق في دور المستقبلات البطانية والليكتين وإنزيمات استقلاب الستيرويد في تطور الآفات الحديدية وتصلب الشرايين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على الآفات من شرايين الرين وتحليلها باستخدام التصوير المقطعي البصري.