تحليل الأحماض الدهنية المحتوى والتركيب في الطحالب الدقيقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس المحتوى الكلي للأحماض الدهنية وتركيبها في الطحالب الدقيقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير عينة تحتوي على كمية معروفة من الكتلة الحيوية للطحالب المجففة بالتجميد. وتتمثل الخطوة الثانية في تفتيت الكتلة الحيوية للطحالب الدقيقة.

بعد ذلك، يتم استخلاص المكونات المحبة للدهون وعزلها. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء عملية تحويل استري للدهون في ACell إلى استرات ميثيل للأحماض الدهنية. وفي النهاية، يُستخدم كروماتوغرافيا الغاز لتقدير كمية الأحماض الدهنية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تقديرات tric، في كون هذه الطريقة دقيقة للغاية وتقيس بشكل محدد جميع الأحماض الدهنية وجميع المكونات المحبة للدهون الأخرى. سيقوم NDI Afer، وهو فني من مختبرنا، باستعراض الإجراء. قبل البدء في هذا الإجراء، حدد تركيز الوزن الجاف للطحالب بالجرام لكل لتر في مرق المزرعة كما هو مفصل في المرجع المدرج. انقل حجماً من مرق المزرعة يحتوي على 5 إلى 10 milligrams من الوزن الجاف للطحالب إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي.

احسب الكمية الدقيقة من الكتلة الحيوية المنقولة باستخدام تركيز الكتلة الحيوية الذي تم تحديده مسبقاً، ثم قم بطرد العينة مركزياً لمدة خمس دقائق عند 1200 Gs. تخلص من جزء من السائل الطافي، مع ترك 0.25 milliliters تقريباً في الأنبوب. بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الطحالب في السائل الطافي المتبقي عن طريق سحب الراسب وإطلاقه بلطف باستخدام الماصة، ثم انقل خليط الخلايا إلى أنبوب جهاز التكسير بالخرز (bead beater).

باستخدام ماصة سعة 200 µL، اشطف أنبوب الطرد المركزي وطرف الماصة بـ ± 0.15 mL من مياه milli cube، ثم انقل السائل إلى أنبوب جهاز تكسير العينات بالخرز (bead beater). قم بطرد أنبوب جهاز تكسير العينات بالخرز مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند أقصى سرعة دوران (RPM) للتأكد من عدم بقاء أي فقاعات هواء في قاع الأنبوب. عند الانتهاء، قم بتجفيف المادة الموجودة في الأنبوب بالتجميد (lyophilize) وفقاً لما يلي.

قم بتحضير محلول من trip Penta Deano بتركيز 50 milligram per liter في نسبة حجمية معززة من chloroform إلى methanol. وباستخدام ماصة إزاحة موجبة، أضف one milliliter من محلول tripod, no إلى أنبوب الخرز. تحقق من عدم وجود خرزات متبقية داخل غطاء أنبوب طحان الخرز، لأن ذلك سيؤدي إلى تسرب خرزات الأنبوب.

قم بضرب أنبوب الخرز ثماني مرات بسرعة 2,500 RPM لمدة 60 ثانية في كل مرة، مع فاصل زمني مدته 12 ثانية بين كل عملية ضرب. بعد ذلك، انقل المحلول الموجود في خرز من أنبوب الخرز إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي نظيف مقاوم للحرارة سعة 15 milliliter مزود بغطاء لولبي بإدراج من التفلون. اغسل أنبوب الخرز بـ one milliliter من محلول tripod، no، وانقل سائل الغسيل إلى أنبوب الطرد المركزي الزجاجي.

كرر العملية مرتين إضافيتين. قم برج العينة باستخدام جهاز vortex لمدة خمس ثوانٍ، ثم عرضها للموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق. بعد عملية السونكة، أضف 2.5 milliliters من محلول مائي pH 7 milli cube يحتوي على 50 millimolar triss و1 molar sodium chloride إلى أنبوب الطرد المركزي.

بمجرد خلط العينة بجهاز الفورتيكس وإجراء عملية السونيكة مرة ثانية، يتم طردها مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 1200. وعند الانتهاء، انقل طور الكلوروفورم السفلي بعناية إلى أنبوب زجاجي نظيف باستخدام ماصة باستير زجاجية، ثم كرر عملية الاستخلاص باستخدام 1 mL من الكلوروفورم. وعند الانتهاء، اجمع طور الكلوروفورم باستخدام ماصة باستير زجاجية واجمعه مع جزء الكلوروفورم الأول.

بخر الكلوروفورم باستخدام تيار من غاز النيتروجين للحصول على الدهون المستخلصة المجففة. بعد ذلك، أضف ثلاثة ملي لتر من الميثانول الذي يحتوي على 5% حمض الكبريتيك إلى الأنبوب الذي يحتوي على الدهون المستخلصة المجففة وأغلقه بإحكام. قم برج العينة باستخدام جهاز الفورتيكس لمدة خمس ثوانٍ.

قم بتحضين العينات لمدة ثلاث ساعات عند 70 °C في سخان كتلي (block heater). تأكد بشكل دوري من عدم غليان العينات، وقم برج الأنبوب باستخدام جهاز الرج (vortex) بعد كل عملية فحص للعينات. بمجرد تبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة، أضف 3 mL من ماء milli cube و 3 mL من n heane إلى الأنبوب، ثم اخلط المكونات باستخدام جهاز الرج (vortex).

قم برج العينة لمدة 15 دقيقة باستخدام جهاز تدوير أنابيب الاختبار. بعد إخراج العينات من جهاز تدوير أنابيب الاختبار، قم بطردها مركزياً لمدة خمس دقائق عند 1200 Gs. باستخدام ماصة زجاجية، اجمع 2 mL من طور الهكسان العلوي وانقله إلى أنبوب زجاجي جديد. لغسل طور الهكسان الذي تم جمعه، أضف 2 mL من مياه milli Q إلى الأنبوب الزجاجي.

بعد ذلك، قم برج العينة بجهاز المرج (vortex) لمدة خمس ثوانٍ، ثم قم بطردها مركزياً لمدة خمس دقائق. وعند قوة 1200 Gs، انقل طور الهكسان من الأنبوب الزجاجي إلى قارورة GC باستخدام ماصة باستير زجاجية. ثم ضع غطاءً على قارورة GC وأحكم إغلاقه لمنع تبخر المذيب.

ضع قارورة العينة في جهاز أخذ العينات التلقائي الخاص بجهاز GC fit. وأخيراً، قم بتشغيل العينة على الجهاز باستخدام عمود فصل جديد بمعدل تدفق إجمالي قدره 20 milliliters per minute وحجم حقن قدره 1 µL. راجع البروتوكول النصي لمعرفة مواصفات العمود والظروف الكروماتوغرافية.

يظهر هنا كروماتوجرام نموذجي يتم الحصول عليه عبر هذه العملية. يتم فصل إسترات ميثيل الأحماض الدهنية حسب الحجم ودرجة التشبع بواسطة عمود GC، ووفقاً للبروتوكول المستخدم، فإن الأحماض الدهنية ذات السلاسل الأقصر والأحماض الدهنية الأكثر تشبعاً تكون أوقات احتجازها أقصر. لا يهدف عمود GC والبروتوكول المستخدمان إلى فصل متصاوغات الأحماض الدهنية، ولكن يمكن تحقيق ذلك باستخدام عمود GC وبروتوكول مختلفين.

يظهر هنا محتوى الأحماض الدهنية وتركيبها في C Desus UEX 3 93 تحت ظروف كفاية النيتروجين ونقصه. وقد بلغ إجمالي محتويات الأحماض الدهنية 8.6 ± 0.5% و 44.7 ± 1.7% تحت ظروف زراعة غنية بالنيتروجين ومحرومة منه على التوالي. وتوضح هذه القيم أن تركيب ومحتوى الأحماض الدهنية يتأثران بشدة بالتجويع النيتروجيني.

يعد حمض البالمتيك وحمض الأوليك أكثر الأحماض الدهنية وفرة في ESBL. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل حول حساب محتوى الأحماض الدهنية وتركيبها. يظهر هنا محتوى الأحماض الدهنية وتركيبها في Odum Trico UEX 6 4 0 تحت كل من ظروف كفاية النيتروجين ونقصه.

على غرار طحالب UUs المائلة، يتأثر محتوى الأحماض الدهنية وتركيبها بشكل كبير بنقص النيتروجين. ففي ظروف كفاية النيتروجين وظروف نقصه، كان إجمالي محتوى الأحماض الدهنية 11.7 ± 0.9% و 30.5 ± 1.1% على التوالي. كما ينتج P trium كميات كبيرة من الأحماض الدهنية غير المشبعة بدرجة عالية مثل I csap و Penta IC acid.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن الأحماض الدهنية طويلة السلسلة جداً مثل حمض الليغنيريك (ligner acid) باستخدام هذه الطريقة. يمكن توسيع هذا الإجراء من خلال إدراج خطوة لفصل الجلطات الدهنية بين مرحلتي استخلاص الدهون والأسترة التبادلية للحصول على رؤية إضافية حول تكوين فصائل الدهون في الـ micro LG، كما هو موضح في المراجع الواردة في نص البروتوكول.