تحليل الأحماض الدهنية المحتوى والتركيب في الطحالب الدقيقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس إجمالي محتوى الأحماض الدهنية وتكوينها في الطحالب الدقيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير عينة تحتوي أولا على كمية معروفة من الكتلة الحيوية للطحالب المجففة. الخطوة الثانية هي تعطيل الكتلة الحيوية للطحالب الدقيقة.

بعد ذلك ، يتم استخراج المكونات المحبة للدهون وعزلها. الخطوة الأخيرة هي إعادة الأسترة لدهون ACell إلى استرات ميثيل الأحماض الدهنية. في النهاية ، يتم استخدام كروماتوغرافيا الغاز لتحديد كمية الأحماض الدهنية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تحديد tric ، هي أن هذه الطريقة دقيقة للغاية وتقيس على وجه التحديد جميع الأحماض الدهنية وجميع المكونات المحبة للدهون الأخرى. سيتم توضيح الإجراء NDI AFER ، فني من مختبرنا قبل البدء في هذا الإجراء ، حدد تركيز الوزن الجاف للطحالب بالجرام لكل لتر في مرق الاستزراع كما هو مفصل في المرجع المذكور. انقل حجما من مرق الاستزراع يحتوي على خمسة إلى 10 ملليغرام من الطحالب ، أنبوب الطرد المركزي الزجاجي الغصين الجاف الوزن.

احسب الكمية الدقيقة للكتلة الحيوية المنقولة باستخدام تركيز الكتلة الحيوية المحدد مسبقا ، وقم بالطرد المركزي للعينة لمدة خمس دقائق عند 1200 Gs.تخلص من جزء من المادة الطافية ، تاركا ما يقرب من 0.25 مل في الأنبوب. إعادة التشكيل التالي. قم بتعليق الطحالب في المادة الطافية المتبقية عن طريق سحب الحبيبات برفق لأعلى ولأسفل ، وانقل خليط الخلية إلى أنبوب مضرب الخرز.

باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اشطف أنبوب الطرد المركزي وطرف الماصة ب 0.15 ملليلتر زائد أو ناقص من ماء مكعب ملي وانقل السائل إلى أنبوب مضرب الخرز. قم بالطرد المركزي لأنبوب مضرب الخرزة لمدة دقيقة واحدة بحد أقصى عدد دورات في الدقيقة للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء في قاع الأنبوب. عند الانتهاء ، قم بتجميد المواد الموجودة في الأنبوب بعد ذلك.

قم بإعداد محلول 50 ملليغرام لكل لتر من رحلة بنتا دينو بنسبة حجم مدعمة من الكلوروفورم إلى الميثانول. باستخدام ماصة الإزاحة الموجبة ، أضف ملليلترا واحدا من الحامل ثلاثي القوائم ، بدون محلول لأنبوب الديكور تأكد من عدم وجود حبات متبقية داخل غطاء أنبوب مضرب الخرزة لأن ذلك سيؤدي إلى تسرب حبة الأنابيب.

تغلب على أنبوب الخافق ثماني مرات عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية في كل مرة مع فاصل زمني 122 بين كل خرزة. بعد ذلك ، انقل المحلول في الخرز من أنبوب الخافق المصنوع من الخرزة إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي نظيف مقاوم للحرارة سعة 15 مليلتر مع غطاء لولبي من التفلون. اغسل أنبوب الخافق المصنوع من الخرزة بملليلتر واحد من الحامل ثلاثي القوائم ، بدون محلول ، وانقل الغسيل إلى أنبوب الطرد المركزي الزجاجي.

كرر مرتين أخريين. دوامة العينة لمدة خمس ثوان ثم صوتنة لمدة 10 دقائق. بعد صوتنة عند 2.5 ملليلتر من محلول ماء مكعب الأس الهيدروجيني سبعة ملي يحتوي على 50 مللي مولار تريس ، وكلوريد الصوديوم المولي إلى أنبوب الطرد المركزي.

بمجرد أن يتم تدوير العينة وصوتنة مرة ثانية ، قم بطردها لمدة خمس دقائق عند الساعة 1200. عند الانتهاء ، انقل مرحلة الكلوروفورم السفلية بعناية إلى أنبوب زجاجي نظيف باستخدام ماصة باستي زجاجية ، كرر الاستخراج بملليلتر واحد من الكلوروفورم. عند الانتهاء ، اجمع مرحلة الكلوروفورم باستخدام ماصة زجاجية خلفية وتجمع مع الجزء الأول من الكلوروفورم.

تبخر الكلوروفورم باستخدام تيار غاز النيتروجين لتحمل الدهون المستخرجة المجففة. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من الميثانول الذي يحتوي على 5٪ من حمض الكبريتيك إلى الأنبوب الذي يحتوي على الدهون المستخرجة المجففة وأغلقه بإحكام. دوامة العينة لمدة خمس ثوان.

احتضان العينات لمدة ثلاث ساعات عند 70 درجة مئوية في سخان بلوك. تأكد بشكل دوري من أن العينات لا تغلي وقم بتدوير الأنبوب بعد كل مرة يتم فيها فحص العينات. بمجرد تبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة عند ثلاثة ملليلتر من الماء المكعب وثلاثة ملليلتر من n heane إلى الأنبوب بعد خلط الدوامة.

حرك العينة لمدة 15 دقيقة باستخدام دوار أنبوب الاختبار. بعد إزالة العينات من محور دوار أنبوب الاختبار ، قم بطردها لمدة خمس دقائق عند 1200 Gs.باستخدام ماصة زجاجية ، اجمع ملليلترين من مرحلة الهكسان العلوية وانقلها إلى أنبوب زجاجي جديد. لغسل مرحلة الهكسان المجمعة ، أضف ملليلترين من ماء مللي Q إلى الأنبوب الزجاجي.

ثم قم بتدوير العينة لمدة خمس ثوان وقم بطردها لمدة خمس دقائق. عند 1200 Gs ، انقل مرحلة الهكسان من الأنبوب الزجاجي إلى قارورة GC باستخدام ماصة زجاجية. ثم ضع غطاءا على قارورة GC وشدها لمنع تبخر المذيبات.

ضع قارورة العينة في جهاز أخذ العينات التلقائي لأداة GC fit. أخيرا ، قم بتشغيل العينة على الجهاز باستخدام عمود اتصال جديد باستخدام معدل تدفق إجمالي يبلغ 20 مل في الدقيقة وحجم حقن يبلغ ميكرولتر واحد. راجع بروتوكول النص لمعرفة مواصفات الأعمدة والشروط الكروماتوغرافية؟

هنا مخطط كروماتوغرام نموذجي يتم الحصول عليه من خلال هذه العملية. يتم فصل استرات ميثيل الأحماض الدهنية حسب الحجم ودرجة التشبع بواسطة عمود GC ، ويستخدم البروتوكول الأحماض الدهنية ذات السلسلة الأقصر والأحماض الدهنية الأكثر تشبعا بأوقات احتفاظ أقصر. لا يهدف عمود وبروتوكول GC المستخدم إلى فصل أيزومرات الأحماض الدهنية ، ولكن يمكن تحقيق ذلك باستخدام عمود وبروتوكول GC مختلفين.

عرض محتوى الأحماض الدهنية وتركيبة C Desus UEX 3 93 في ظل كل من ظروف النيتروجين الكافي والمحروم. وبلغ إجمالي محتويات الأحماض الدهنية 8.6 زائد أو ناقص 0.5٪ و44.7٪ زائد أو ناقص 1.7٪ في ظل ظروف الزراعة المليئة بالنيتروجين وظروف الزراعة المحرومة من النيتروجين على التوالي. توضح هذه القيم أن تكوين الأحماض الدهنية ومحتواها يتأثران بشدة بتجويع النيتروجين.

في ESBL ، يعد حمض البالمتيك وحمض الأوليك أكثر الأحماض الدهنية وفرة. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل حول حساب محتوى الأحماض الدهنية وتكوينها؟ يظهر هنا محتوى الأحماض الدهنية وتركيبة Odum Trico UEX 6 4 0 في ظل كل من ظروف النيتروجين الكافي والمحروم.

على غرار UUs المائلة ، يتأثر محتوى الأحماض الدهنية وتكوينها بشكل كبير بتجويع النيتروجين. في ظل ظروف النيتروجين الكافي والمحروم ، كان إجمالي محتويات الأحماض الدهنية 11.7 زائد أو ناقص 0.9٪ و 30.5 زائد أو ناقص 1.1٪ على التوالي. ينتج P trium أيضا كميات كبيرة من الأحماض الدهنية غير المشبعة للغاية مثل I csap ، حمض Penta IC.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا اكتشاف الأحماض الدهنية طويلة السلسلة مثل حمض ligner بهذه الطريقة. يمكن تمديد هذا الإجراء من خلال تضمين خطوة فصل الجلطة الدهنية بين استخراج الدهون وخطوة الأسترة التبادلية للحصول على نظرة ثاقبة إضافية لتكوين فئة الدهون في micro LG كما هو موضح في المراجع في نص البروتوكول.