بمساعدة مصفوفة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة (MALDI-TOF) قداس التحليل الطيفي من البروتينات سليمة أكبر من 100 كيلو دالتون

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل البروتينات السليمة التي يزيد حجمها عن 100 كيلودالتون بطريقة حساسة عن طريق قياس الطيف الكتلي المالدي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد حلول المصفوفة أولا. الخطوة الثانية هي إيداع محلول الطبقة الرقيقة على الهدف.

بعد ذلك ، يتم ترسيب العينة ومزيج المصفوفات على الهدف. الخطوة الأخيرة هي مراقبة بقع العينة تحت المجهر. في النهاية ، يتم استخدام مطياف متعدد إلى كتلة لتحليل البروتينات السليمة وتسجيل أطياف الكتلة.

الميزة الرئيسية لقياس الطيف الكتلي مالدي على الأساليب التحليلية الأخرى ، مثل التأين بالرش الكهربائي ، هي أنه أكثر تحملا للملح والملوثات والمنظفات. ميزة أخرى ل maldi هي أنه يولد أيونات تحمل شحنات أقل مقارنة بالرش الكهربائي. لذلك ، فإن الحصول على بيانات MDI وتفسيرها أمر بسيط تماما.

لبدء تبلور الهيكل ، صب 10 مل من 40٪ الإيثانول في Pyrex que. ثم عند 600 ملليغرام من المصفوفة باستخدام حمام مائي وسخان مقاومة. قم بتسخين محلول المصفوفة وحركه حتى تذوب المصفوفة تماما.

كرر الخطوات السابقة حتى يتشبع المحلول. اترك المحلول يبرد ببطء في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات ، ثم قم بتخزينه على حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. إذا لم تتشكل البلورات ، فقم بخدش الجزء الداخلي من الدورق أسفل سطح المحلول مباشرة ، باستخدام قضيب زجاجي للحث على التبلور.

أخيرا ، اجمع بلورات المصفوفة عن طريق الترشيح. اشطف البلورات المتبقية في القارورة بأقل قدر من المذيبات المثلجة وقم بترشيحها. بمجرد اكتمال الترشيح ، اترك البلورات تجف لتنظيف لوحة maldi المستهدفة.

اشطفه بالميثانول وامسحه برفق بمنديل كيم. ثم اشطفه بالماء وامسحه بمنديل كيم. أدخل هدف maldi في دورق سعة 600 مل وقم بتغطيته بنسبة 50٪ من الإيثانول.

بعد ذلك ، صوتنة الهدف في محلول الإيثانول لمدة 10 دقائق في حمام بالموجات فوق الصوتية. إذا كانت هناك بقايا متبقية على اللوحة ، كرر الخطوات السابقة. شطف الهدف بالميثانول أو الماء المذيب المستخدم ، ويحدد مقدار انتشار العينة.

ثم قم بإمالة الهدف بحيث يتم جمع كل السائل على منديل كيم. جفف الهدف باستخدام تدفق غاز النيتروجين. في الخطوة التالية ، قم بإذابة alpha CHCA في الأسيتون.

لصنع محلول مشبع، اغمس طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر في محلول ألفا CHCA المشبع بحيث تتدفق كمية صغيرة من المحلول في الحافة. المس هدف maldi بسرعة باستخدام طرف الماصة لإيداع محلول alpha CHCA على هدف maldi باستخدام أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 ملليلتر. قم بإعداد محلول 20 ملليغرام لكل مليلتر ألفا CHCA عن طريق إذابة ألفا CHCA بنسبة من سبعة إلى ثلاثة أحجام من الأسيتونيتريل إلى 5٪ حمض الفورميك ، المسمى المحلول باسم محلول ألفا CHCA.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول DHB 20 ملليغرام لكل مليلتر عن طريق إذابة DHB بنسبة حجم سبعة إلى ثلاثة من أسيتيل النتريل إلى 0.1٪ حمض الخليك ثلاثي الفلورو ، المسمى المحلول باسم محلول DHB. امزج محلول alpha CHCA ومحلول DHB بنسبة حجم واحد إلى واحد. للحصول على محلول C-H-C-A-D-H-B قبل البدء في هذا الإجراء ، تتمثل الخطوة الاختيارية في تنقية عينات البروتين عن طريق التبادل المؤقت الموضح في المرجع المدرج.

خلاف ذلك ، قم بإيداع عينة بروتين غير منقى على هدف MALDI. بعد ذلك ، قم بإيداع 0.5 ميكرولتر من عينة البروتين على الطبقة الرقيقة ألفا CHCA المحضرة. بعد ذلك مباشرة ، أضف 0.5 ميكرولتر من محلول C-H-C-A-D-H-B.

ضع 0.5 ميكرولتر من معيار Cain على لوحة MALDI ، ثم أضف 0.5 ميكرولتر من محلول المصفوفة. بمجرد تجفيف العينات والقابيل ، يمكنك مراقبة البقع تحت المجهر ، وإدخال الهدف في الأداة ، واختيار إعداد الأداة المناسب. ثم اختر نطاق نسبة الكتلة إلى الشحن المناسب.

احصل على أطياف الكالس ومعايرة الأداة باستخدام شدة الليزر المناسبة. الحصول على أطياف عينات البروتين. تحليل MALDI toff لمنطقة الكروموسوم السليمة يتم عرض بروتين واحد للصيانة هنا.

أسفر خليط C-H-C-A-D-H-B عن أطياف كتلية ذات جودة أعلى من حيث نسبة الإشارة إلى الضوضاء والحساسية. على وجه الخصوص ، يمكن اكتشاف 0.5 بيكومول من البروتين المودعة على هدف MALDI ، في حين أن نفس الكمية من البروتين بالكاد يمكن اكتشافها باستخدام حمض SINO NIC باستخدام خليط C-H-C-A-D-H-B ، لوحظت أيونات مشحونة مضاعفة للبروتين ، مما يسمح بتحديد الكتلة بدقة أعلى لأن دقة الذروة تتناسب عكسيا مع نسبة الشحنة الرئيسية في حالة أداة متعددة الأطراف. علاوة على ذلك ، باستخدام خليط C-H-C-A-D-H-B ، كانت طريقتنا المفضلة لترسيب المصفوفة هي نهج الطبقة الرقيقة.

باستخدام طريقة القطرات المجففة ، لم يتم الكشف عن البروتينات التي تزيد كتلتها عن 100 كيلودالتون. تم تحليل بروتين aase الذي يجمع بيتا الأحادي بواسطة TOF متعدد أيضا. كانت أطياف C-H-C-A-D-H-B أفضل من أطياف حمض SINO NIC من حيث الحساسية والدقة.

علاوة على ذلك ، فإن وجود أيونات مشحونة مضاعفة مكن من تأكيد كتلة البروتين بدقة أعلى. يظهر هنا MALDI لتحليل الغلوبولين المناعي السليم. كانت الأطياف التي تم الحصول عليها باستخدام خليط C-H-C-A-D-H-B أكثر كثافة بكثير من أطياف SA و alpha CHCA.

وبشكل أكثر تحديدا ، كانت إشارات البروتين أعلى ولديها دقة أفضل في أطياف C-H-C-A-D-H-B. أظهر استخدام خليط C-H-C-A-D-H-B وطريقة ترسيب الطبقة الرقيقة تحسينات كبيرة في جودة البروتين الكبير السليم. اكتسبت Mass Spectra باستخدام MALDI إلى أداة.

يوضح البروتوكول المقدم كيفية الحصول على أطياف كتلة عالية الجودة من البروتينات ذات الوزن الجزيئي العالي باستخدام العديد من الأدوات. أثناء إجراء هذا النوع من التحليل ، هناك ثلاثة أشياء مهمة. أولا ، لاستخدام حل مقاييس معد حديثا.

ثانيا ، لإيداع عينتك بشكل صحيح على هدف مالي. وثالثا ، لاستخدام الإعداد الآلي المناسب مثل شدة الليزر.