النهج الوراثية إلى الأمام في

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحليل جيني على بكتيريا chlamydia tritus عن طريق تنفيذ طفرات كيميائية وتحديد الارتباطات بين النمط الجيني والنمط الظاهري. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توليد سلالات طافرة من chlamydia tracom باستخدام الطفرات الكيميائية. بعد ذلك، يتم تحديد جميع الطفرات الناتجة كيميائياً بواسطة تسلسل الجينوم الكامل، يليه تجميع الجينوم الموجه بالمرجع.

بعد ذلك، يتم تحديد الارتباطات بين النمط الظاهري والنمط الجيني في السلالات الطافرة. وأخيراً، يتم تأكيد هذه الارتباطات من خلال توليد سلالات معاد التركيب وتحليلها. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن طفرة في جين معين من جينات chlamydia تؤدي إلى نمط ظاهري مستهدف، وذلك عبر الجمع بين نهج الطفرات الكيميائية الكلاسيكية وتقنيات تسلسل الجيل القادم.

لا تتوفر حالياً أي طرق لاستبدال الجينات في الكلاميديا، كما أن الأدوات الجينية الجزيئية لدراستها لا تزال في مراحلها الأولى. لا تتطلب هذه الطريقة التحول باستخدام الحمض النووي معاد التركيب (recombinant DNA) أو تطوير أدوات جينية جزيئية، ومع ذلك فهي تحقق الهدف ذاته، وهو تحديد الوظيفة الخاصة بنواتج جينية فردية.

لتحضير الخلايا المستزرعة، قم بتوزيع حوالي 1 × 10⁶ من خلايا vir لكل 25 سنتيمتراً مربعاً في 3 مل من وسط DMEM المدعم بـ 10% FBS، ثم حضنها عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الخلايا إلى حالة الاندماج الكامل (confluency) بعد حوالي 24 ساعة، قم بشفط الوسط واصِب الخلايا ببكتيريا chlamydia بمضاعفات عدوى (MOI) قدرها 5، وذلك في حجم إجمالي قدره 3 مل من DMEM-FBS يحتوي على 200 نانوغرام/مل من cycloheximide. لبدء عملية الطفرات (mutagenesis) بعد 18 ساعة من الإصابة، قم بتحضير 20 ملغ/مل من ethyl methane sulfonate أو EMS في PBS يحتوي على كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم، وذلك تحت غطاء كيميائي.

تعتبر مادة EMS مادة مطفرة ومسرطنة قوية. لذا، يرجى الرجوع إلى البروتوكول النصي لمعرفة كيفية التخلص منها. قم بشفط الوسط من خلايا Vero واغسلها مرة واحدة باستخدام ثلاث milliliters من PBS المحتوي على كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم.

ثم يُضاف 3 mL من محلول EMS ويُحضن لمدة ساعة واحدة في خزانة استخلاص الأبخرة في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، يتم إزالة EMS ووضعه في وعاء يحتوي على 1 M من هيدروكسيد الصوديوم لإبطال مفعول المادة المطفرة قبل غسل الخلايا ثلاث مرات لإزالة أي بقايا من EMS. ثم يُضاف 6 mL من DMEM يحتوي على 10% FBS مع 200 ng/mL من cyclo heximide و 25 µg/mL من Gentamycin ويُحضن عند 37 °C مع 5% CO2 لمدة تتراوح بين 48 إلى 72 ساعة.

تظهر الاجتثاثات خالية من البكتيريا بعد حوالي 36 ساعة من التطفير عند 72 ساعة. تكون حوالي 10% من الاجتثاثات مليئة بالبكتيريا بينما تظل البقية فارغة لاستخلاص الأجسام الأولية أو EBS عن طريق التحلل بنقص التوترية؛ قم بشفط الوسط تماماً. أضف 1 مليليتر من الماء ورجّ العينة لمدة 10 دقائق لفصل الخلايا، ثم قم بتحليل الخلايا عن طريق السحب والدفع بالمصاصة لـ 10 مرات على الأقل.

بعد جمع المستخلص في أنبوب طرد مركزي دقيق، أضف 0.25 milliliters من محلول السكروز وفوسفات الغلوتامات المنظم (SPG) بتركيز 5x للوصول إلى تركيز نهائي 1x، ثم يُحفظ عند درجة حرارة -80 °C. قم بتجهيز طبقات أحادية متلاحمة من خلايا VES في أطباق سداسية الفتحات عبر استزراع حوالي 0.4 × 10⁶ من الخلايا في 3 milliliters من وسط DMEM 10%FBS لكل فتحة، واترك الخلايا لتشكل طبقة أحادية متجانسة على مدار الـ 24 ساعة التالية. بعد ذلك، ضع محلولاً مركزاً من المطفر Chlamydia على الثلج.

بعد ذلك، قم بتحضير ستة أنابيب من التخفيف التسلسلي عشري المرات بحجم إجمالي قدره 200 µL لكل تخفيف في وسط DMEM 10%FBS، وضعها على الثلج. استخدم 3 mL من PBS لكل بئر لغسل خلايا Vero مرتين. ثم أضف 3 mL من DMEM إلى كل بئر في أطباق الستة آبار، و100 µL من التخفيف البكتيري في مكررات ثنائية.

قم بتحريك الطبق بشكل دائري لضمان خلط المكونات بالتساوي. قم بتدوير الأطباق المصابة بسرعة 2,700 GS لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 15 °C. بعد ذلك، قم بتحضينها عند درجة حرارة 37 °C في حضانة مرطبة تحتوي على 5% carbon dioxide لمدة تتراوح بين ساعة إلى ساعتين.

في هذه الأثناء، قم بتحضير 0.54%AROS في DMEM عن طريق دمج المكونات التالية أولاً وخلطها. بعد ذلك، امزج 18.9 milliliters من 1.2%aros المعقم الساخن في الماء، مع التقليب لمنع التكتل. حافظ على دفء الخليط في حمام مائي بدرجة حرارة 55 degrees Celsius.

قم بسحب المعلق البكتيري من الأطباق وأضف ستة ملليلتر من محلول aro الدافئ. اتركه يتصلب تمامًا في درجة حرارة الغرفة خارج غطاء التدفق الصفائحي. ثم في غطاء السلامة البيولوجية مع إزالة الأغطية، جفف الأطباق لمدة 15 دقيقة إضافية، وعندما تجف الأطباق، قم بتحضينها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة تتراوح من سبعة إلى 10 أيام.

يجب أن تكون اللويحات مرئية باستخدام المجهر التشريحي قبل يوم واحد من عزل الطفرات. قم بزراعة 1×10⁴ خلايا في 100 µL لكل بئر. في لوحة ذات 96 بئراً، ستصل الخلايا إلى حالة التلاقي خلال 24 ساعة.

باستخدام مجهر تشريحي، حدد اللويحات المراد التقاطها، ثم استخدم ماصة حاجزية معقمة سعة واحد ملليلتر لجمع سدادات من اللويحات. أعد تعليق اللويحات في 100 µL من وسط DMEM المكمل بـ 10% FBS و 400 ng/mL من cycloheximide و 50 µg/mL من Gentamicin لتوسيع السلالات الطافرة، ثم ضع المعلق فوق طبقات أحادية متلاصقة من خلايا Vero.

قم بدوران الأطباق بسرعة 2,700 GS وعند درجة حرارة 15 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل تحضين الحصاد عندما تكون نسبة الخلايا المصابة أكبر من 50%، وهو ما يمكن أن يحدث في وقت مبكر يصل إلى 48 ساعة بعد العدوى وبحد أقصى 14 يوماً. تتيح هذه الكمية من الخلايا المصابة تخزين ما يكفي من البكتيريا القابلة للحياة لاستخلاص EVs عن طريق التحلل بنقص التوتر للخلايا المصابة. بعد شفط الوسط، أضف 160 microliters من الماء المعقم واحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

استخدم رؤوس ماصات مزودة بحواجز (barrier tips) لتفكيك الخلايا عن طريق السحب والدفع بالماصة لعدة مرات لضمان التحلل الكامل. وأخيراً، انقل 160 µL من كل محلول تحلل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة. أضف 40 µL من XSPG بتركيز خمسة أضعاف (five XSPG) واحفظها في درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت المقايسة وفحص الطفرات بحثاً عن الأنماط الظاهرية ذات الصلة.

يؤدي التعرض للمواد المطفّرة إلى تكوين اشتمالات تبدو خالية من البكتيريا، ويرجع ذلك على الأرجح إلى موت الخلايا البكتيرية. عادةً ما تقوم السلالة المصلية LGVL two بتحليل الخلايا المصابة تماماً في غضون 48 ساعة بعد العدوى، ولكن العلاج بالمطفرات يمكن أن يمدد هذه الدورة إلى أكثر من 90 ساعة، ومن المتوقع أن تتعافى حوالي 10% من الاشتمالات في تجاربنا. أدى علاج خلايا Vero المصابة بـ 20 mg/mL من EMS إلى انخفاض بنسبة 99% في استعادة النسل المعدي مقارنة بالمجموعات الضابطة غير المعالجة كما هو موضح في هذا الشكل.

أدى العلاج بالمطفرات أيضاً إلى ظهور لويحات ذات مورفولوجيات متغيرة، بما في ذلك اللويحات الصغيرة. وتشمل المورفولوجيات الأخرى لويحات تظهر بشكل حبيبي، أو متكتل، أو على شكل قرص العسل كما هو موضح هنا. ويمكن أن تؤدي جرعات EMS المستخدمة في هذه الدراسات إلى حدوث ما بين 3 إلى 30 طفرة لكل جينوم KCL، وفقاً لما تم تقييمه تجريبياً بواسطة NGS.

على الرغم من أن أجسام EBS المنقاة بالتدرج تكون خالية إلى حد كبير من مواد الخلية المضيفة، إلا أنه يتم الكشف أيضاً عن الحمض النووي للمضيف، والذي يشكل حوالي 10 إلى 15% من تحضيرات الجينوم التي تلي هذا الإجراء. ويمكن إجراء فحوصات للأنماط الظاهرية، مثل ضعف التكاثر في خلايا المزرعة النسيجية، أو فقدان الأنشطة الكيميائية الحيوية، أو تغير المورفولوجيا البكتيرية، وذلك من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العوامل البكتيرية المطلوبة لتكوين وصيانة عوامل إمراضية chlamydia.