نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم نقل نظام إيصال دواء أو عامل علاجي. حيث يتم نقله عبر حاجز خلوي مثل نموذج لظهارة الجهاز الهضمي ذات الصلة بإيصال الأدوية عن طريق الفم. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع خلايا caco two على أدراج transwell للسماح بتمايز الخلايا وتكوين طبقة أحادية من الخلايا.

تتمثل الخطوة الثانية في التحقق من أن هذا النموذج يمثل حاجزاً نفوذياً من خلال قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة، وتلوين الوصلات الخلوية مناعياً، وتقييم النفوذية السلبية لجزيء تتبع قابل للكشف. والخطوة التالية هي تحضير نظام إيصال الدواء، حيث تُستخدم في هذا المثال ناقلات نانوية بوليمرية مستهدفة. قد تحتوي الناقلات على شحنة دوائية أو لا تحتوي، ويجب إدراج ضوابط مثل الناقلات غير المستهدفة أو الدواء الحر.

تُوسم هذه العناصر بالنظائر المشعة للسماح بالكشف عنها. ثم تُضاف الناقلات إلى الحجرة القمية فوق الطبقة الخلوية الأحادية بعد فترة التحضين. وفي نقاط زمنية متفاوتة، تُجمع الناقلات من الحجرة القمية، والحجرة القاعدية الجانبية، والطبقة الخلوية الأحادية، وتُفحص للكشف عن أي تحلل محتمل للمكون الموسوم.

يتم بعد ذلك حساب نقل الناقلات النانوية عبر الطبقة الخلوية الأحادية، وذلك لاستقصاء آلية النقل. ويجب إجراء تجارب مماثلة بوجود مثبطات دوائية لعملية النقل عبر الخلايا (transcytosis) أو باستخدام مؤشرات للنقل بين الخلايا (paracellular transport). إن التقنية التي نصفها هنا هي تكييف لطرق راسخة تُستخدم لتقييم معدل وآلية نقل الأدوية والناقلات النانوية الدوائية عبر الطبقات الخلوية الأحادية في المزرعة، والتي تمثل الحواجز الخلوية في الجسم.

على الرغم من أن المثال الذي ركزنا عليه هنا يثبت نقل جسيمات بوليمرية نانوية مستهدفة عبر نموذج للظهارة المعدية المعوية، إلا أنه يمكن تطبيق طرق مماثلة لفحص مرور أنظمة توصيل أدوية مختلفة عبر هذه الطبقات الخلوية الأحادية أو طبقات أخرى، مثل الخلايا البطانية التي تشكل عادةً حاجزاً بين مجرى الدم والأنسجة والأعضاء. على سبيل المثال، في حالة الحاجز الدموي الدماغي، وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبات بسبب مشقة اختيار العلامات المناسبة لتتبع أنظمة توصيل الأدوية بدقة من خلال هذه الدراسات، لا سيما إذا تم نقلها عبر الخلايا بكميات صغيرة.

فيما يخص هذا الجانب، سنستخدم النظائر المشعة لوسم أنظمة إيصال الأدوية في دراساتنا، وثمة مصدر قلق رئيسي آخر يتمثل في التحقق من سلامة حاجز الخلايا النموذجي واستخدام الضوابط المناسبة لإثبات ذلك من خلال التجارب. تُجرى هذه العملية داخل غطاء زراعة خلايا معقم من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية، ويجب تعقيم جميع المواد التي تدخل الغطاء باستخدام الإيثانول؛ وباستخدام الملاقط، يتم وضع إدراجات Transwell المصنوعة من بولي إيثيلين تيريفثالات مسامية بقطر 0.8 micrometer في طبق يحتوي على 24 بئرًا لضمان الحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية.

تتطلب كل حالة تجريبية أربعة تكرارات كحد أدنى. يتم تخفيف خلايا human epithelial colorectal adenocarcinoma أو خلايا caco two في وسط خلوي مُحضّر مسبقاً. ثم ضع من 200 إلى 400 µL من محلول الخلايا في الحجرة العلوية أو القمية من الـ transwell.

قم بالزراعة بكثافة 1.5 × 10⁵ خلية لكل سنتيمتر مربع. املأ الحجرة السفلية أو القاعدية الجانبية من 700 إلى 900 µL من وسط زراعة الخلايا، ثم قم بتحضين الخلايا عند 37 °C و 5% carbon dioxide و 95% humidity لمدة تتراوح من 16 إلى 21 يوماً، مع استبدال الوسط في الحجرتين العلوية والسفلية كل ثلاثة إلى أربعة أيام.

استبدل الوسط بالترتيب التالي للحفاظ على الضغط فوق الطبقة الخلوية الأحادية: اسحب الوسط من الحجرة السفلية، ثم اسحب الوسط من الحجرة العلوية. املأ الحجرة العلوية بـ 200 إلى 400 µL من الوسط الطازج، واملأ الحجرة السفلية بـ 700 إلى 900 µL من الوسط الطازج للتحقق من حاجز النفاذية الظهاري بواسطة جهاز TEER. اضبط جهاز الفولتميتر على إعداد المقاومة وضع الأقطاب الكهربائية عموديًا في بئر يحتوي على غشاء transwell.

يجب أن يكون القطب القصير في الحجرة العلوية والقطب الطويل في الحجرة السفلية بحيث يلامس قاع البئر. بمجرد استقرار قراءة مقياس الفولتمتر، يتم تسجيل قيمة المقاومة بالأوم لكل منهما. تكرر القياسات كل يوم إلى يومين حتى ترتفع القيم وتصل إلى الحد الأقصى ثم تستقر، مما يشير إلى تكوين حاجز نفاذية، وهو أمر يستغرق عادةً من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من لحظة زراعة الخلايا.

للتحقق من وجود الوصلات المحكمة في الطبقات الخلوية أحادية الطبقة في المرحلة الأولى، قم بتثبيت الخلايا، ثم اسحب الوسط الزرعي من كلتا الحجرتين واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DMEM دافئ، ثم قم بالتحضين باستخدام 2% paraform aldehyde بارد لمدة 15 دقيقة. بعد مرور 15 دقيقة، قم بإزالة paraform aldehyde واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك، أضف واحد ميكروجرام لكل ميلليلتر من anti occludin إلى كل منها.

سنستخدم آباراً ذات نفاذية منخفضة كضابط سلبي لتكوين الحاجز. يتم التحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد مرور 30 دقيقة، تُغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS، ثم يُضاف إلى كل بئر أجسام مضادة ثانوية مُعلمة بتركيز 7.5 micrograms per milliliter، وتُحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. وأخيراً، تُغسل الخلايا باستخدام PBS، ويُستأصل غشاء الترشيح الذي تلتصق به الطبقة أحادية الخلايا المُثبتة بعناية، ثم يُثبت على شرائح للتصوير باستخدام مجهر الإضاءة العلوية (epi)، أو مجهر الفلورسنت، أو المجهر البؤري (confocal microscopy).

تبدأ هذه العملية بوسم الأجسام المضادة المستهدفة باليود 1 25 وحساب النشاط النوعي للجسم المضاد الموسوم بعدد النبضات في الدقيقة لكل ميكروغرام باستخدام بروتوكولات منشورة مسبقاً. في هذا المثال، الجسم المضاد المستهدف هو جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر ضد جزيء الالتصاق بين الخلايا البشري 1 أو مضاد ICAM one للتحقق من النوعية. وسيُستخدم IgG من الفأر موسوم باليود 1 25 لتحضير ناقلات نانوية مغلفة غير مستهدفة لدراسة نقل حمولة علاجية.

يتم أيضاً وسم الحمولة بـ iodine 1 25. وفي هذا المثال، الحمولة هي alpha galacto SASE أو Alpha G، وهو إنزيم علاجي يُستخدم لعلاج مرض فابري، وهو اضطراب تخزيني ليزوزومي وراثي. ويعد ضمان الكشف الكافي عن المواد المنقولة أحد أصعب جوانب هذا الإجراء.

لضمان النجاح، يجب وسم مكونات الناقلات النانوية بكمية كافية من النظائر ذات النشاط النوعي العالي. الخطوة التالية هي ربط مضاد ICAM الموسوم بسطح الناقلات النانوية. في هذه الحالة، نقوم ببساطة بخلط مضاد ICAM الموسوم بـ iodine 1 25 مع حبيبات بوليسترين نانوية بقطر 100 nanometer كنموذج للتحكم غير النوعي.

استخدم IgG المسمى بـ iodine 1 25، ولتتبع نقل الشحنة، استخدم مزيجاً من anti ICAM و Alpha G المسمى بـ iodine 1 25. قم بتحضين الخلائط لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للسماح بالامتصاص السطحي، وبعد مرور ساعة واحدة، قم بالطرد المركزي عند 13,000 GS لمدة ثلاث دقائق، ثم أزل النظائر غير المغلفة الموجودة في الراشح باستخدام ماصة شفط لتعليق الراسب الذي يحتوي على الناقلات النانوية المغلفة في 1% Bovine serum albumin في PBS، وبعد ذلك قم بعملية السونيكة بقدرة منخفضة لتفكيك أي تجمعات جسيمية محتملة. أضف الناقلات النانوية anti ICAM المسمى بـ iodine 1 25 إلى الحجرة العلوية فوق طبقات أحادية متلاصقة من caco two مع استخدام high tier. كرر الإجراء للنظائر غير النوعية والعلاجية بعد قياس tear.

يتم التحضين عند 37 °C لفترة زمنية واحدة أو أكثر من الفترات المحددة. تُقاس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (tear) مرة أخرى بعد التحضين. تُستخدم قياسات tear لتقييم تأثيرات الناقلات النانوية على حاجز النفاذية.

اجمع الوسط من الحجرتين العلوية والسفلية. اغسل الحجرة العلوية بـ 0.5 milliliters من DMEM عند 37 °C والحجرة السفلية بـ 1 milliliter من الماء منزوع الأيونات. اجمع محاليل الغسيل لقياس المحتوى الإجمالي للنظائر المشعة باستخدام عداد غاما لقياس الجزء الخلوي.

استأصل المرشح النفاذ باستخدام شفرة حلاقة للقص حول الحواف. قم بتحضينه في أنبوب عدّ غاما مع 1% Triton X 100 لمدة 10 دقائق لتحرير محتويات الخلايا قبل قياس إجمالي النشاط الإشعاعي المرتبط بالخلايا، وذلك لقياس iodine 1 25 المتحرر من الناقلات النانوية أثناء النقل أو نتيجة التحلل المحتمل. أولاً، اخلط 300 µL من كل عينة مع 700 µL من 3% BSA في PBS و 200 µL من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك أو TCA، ثم حضّن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

خلال فترة الحضن هذه التي تستغرق 15 دقيقة، قم بقياس النشاط الإشعاعي الكلي للعينات باستخدام عداد غاما، ثم قم بطرد عينات TCA مركزياً عند 3000 GS لمدة خمس دقائق لفصل البروتين السليم عن البروتين المتحلل أو جزء iodine 1 25. قم بتحديد كمية النشاط الإشعاعي لجزء iodine 1 25 الحر واطرح هذه القيمة من إجمالي النشاط الإشعاعي الذي تم قياسه قبل عملية الطرد المركزي. سيوفر هذا كمية البروتين المسمى مقابل جزء المقتفي الإشعاعي الذي انفصل عنه لتقييم النقل عبر الخلايا باستخدام تسرب الألبومين عبر الخلايا؛ حيث يتم زراعة طبقات KCO two أحادية على حوامل transwell كما تم توضيحه سابقاً، وفي الحجرة العلوية، يضاف إلى الوسط الموجود فوق الطبقة الخلوية أحادية الخلية إما albumin المسمى بـ iodine 1 25 وحده كعنصر تحكم سلبي لإظهار المستوى الأساسي للتسرب أو iodine.

ألبومين مُعلم بـ 1 25 وجسم مضاد غير مُعلم إشعاعياً. يتم تحضين الناقلات النانوية المستهدفة عند درجة حرارة 37 °C للفترات الزمنية المحددة، والتي يجب أن تتطابق مع تلك التي تم فحصها عند اختبار nz.Transport. يتم قياس الدموع كما تم توضيحه سابقاً قبل التحضين وأثناءه وبعده.

اجمع كافة الأجزاء بعد الحضن لقياس إجمالي اليود 1 25 واليود 1 25 الحر كعنصر تحكم إيجابي لفتح الوصلات بين الخلوية. أضف وسطاً خلوياً يحتوي على 5 millimolar من بيروكسيد الهيدروجين إلى الحجرتين العلوية والسفلية من جهاز transwell. أدخل العينة واحضنها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.

قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (tear) وأضف iodine 1 25 albumin إلى الحجرة العلوية للفترات الزمنية المحددة. قم بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة في نقاط زمنية مختلفة طوال فترة الحضن لتحديد مدى انخفاض قيمتها الناتج عن فتح الوصلات الخلوية بفعل بيروكسيد الهيدروجين. وفي تجارب موازية، قم بتقييم النقل عبر الخلايا أو النقل الخلوي (transcytosis) للناقلات النانوية المستهدفة بـ iodine 1 25 عن طريق حضن طبقات أحادية متلاحمة من خلايا Caco two مع كل من هذه المثبطات.

50 µM من MDC، وهو مثبط لعملية الالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين. و1 µg/mL من filipin، وهو مثبط لعملية الالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين. و0.5 µM من WT mannin، وهو مثبط لإنزيم Phosphatidylinositol three kinase المشارك في عملية الالتقام الخلوي الكبير، و20 µM من EIPA.

كمثبط لعمليتي الماكرو-بينوسيتوز (macropinocytosis) والالتقام الخلوي بوساطة الكيمياء، تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) قبل وأثناء وبعد تحضين الخلايا مع المثبطات والمواد الموُسمة إشعاعياً كعنصر تحكم إضافي لتأثير المثبطات على نفاذية الطبقة الأحادية للتحقق من صحة طبقات Caco-2 الأحادية كنموذج للنقل عبر الظهارة للناقلات النانوية الموجهة. تم تنمية خلايا Caco-2 على حشوات Transwell بكثافة 1.5 × 10⁵ خلية لكل سنتيمتر مربع، وقِيست المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) لتقييم سلامة الطبقة الأحادية؛ وكما يظهر في هذا الرسم البياني، وصلت الطبقة الأحادية إلى حالة التلاقي في اليوم 12 وحافظت على سلامتها حتى اليوم 18. تم التحقق من هذه النتيجة بشكل أكبر من خلال وجود وصلات محكمة إيجابية لبروتين الأوكلودين (occludin) في الطبقات الأحادية ذات قيمة TEER العالية التي بلغت 380 ohms/cm² في اليوم 14، مقارنة بتوسيم ضعيف للوصلات المحكمة عند قيمة TEER منخفضة بلغت 17 ohms/cm². وفي اليوم الخامس، ولتقييم نقل الناقلات النانوية المضادة لـ ICAM عبر طبقات خلايا Caco-2 الأحادية، تم تحضين طبقات Caco-2 الأحادية المتلاقية المنماة على حشوات Transwell مع ناقلات نانوية مضادة لـ ICAM موُسمة بـ iodine 125 تمت إضافتها إلى الحجرة القمية.

تم قياس محتوى Iodine 1 25 في الحجرة القاعدية الجانبية عند النقاط الزمنية المحددة لحساب كمية الناقلات النانوية المنقولة لكل خلية كما هو موضح في اللوحة العلوية؛ وفي اللوحة السفلية، تم حساب النسبة المئوية للناقلات النانوية المنقولة كنسبة الناقلات الموجودة في الجزء القاعدي الجانبي إلى تلك الموجودة في مجموع الجزئين القاعدي الجانبي والخلوي. كما تمت مقارنة هذه المعايير المقدرة في هذا المثال لناقلات Iodine 1 25 anti ICAM النانوية بتلك الخاصة بمجموعة الضابطة من ناقلات Iodine 1 25 IgG النانوية لتوضيح كفاءة النقل مقارنة بنظير غير مستهدف، وتظهر النتائج في اللوحة العلوية.

تم أيضاً حساب معاملات النفاذية الظاهرية التي تعكس معدلات نقل الناقلات النانوية anti ICAM الموسومة بـ iodine 1 25 أو الناقلات النانوية IgG الموسومة بـ iodine 1 25 كما هو موضح في اللوحة السفلية عندما يتم دمج الوسم الإشعاعي في الحمولة النانوية. تعكس المعلمات الموصوفة نقل الحمولة، والتي تكون في هذا المثال إنزيم alpha GA المستخدم في علاج اضطراب تخزين ليسوسومي وراثي يُعرف باسم Fabry Disease. تم قياس محتوى النظائر المشعة في الكسور القمية والقاعدية والخلية عند ثلاث ساعات و24 ساعة، وتحويلها إلى قيم مختلفة ذات صلة بالنقل كما هو موضح في هذا الجدول.

بالإضافة إلى حساب نقل الناقلات النانوية من خلال تتبع الحمولة، يمكن تقدير التوصيل عبر الظهارة لهذا الإنزيم العلاجي عن طريق التعبير عنه كجزيئات أو بيكوغرامات من Alpha-gal المنقولة لكل خلية. كما تم استقصاء آلية نقل الناقلات النانوية المضادة لـ ICAM عبر طبقات Caco الأحادية؛ حيث تم تقييم النقل عبر الخلايا للناقلات النانوية المضادة لـ ICAM الموسومة بـ iodine 1 25 عبر طبقات Caco two الأحادية الملتئمة عند 24 ساعة في غياب أو وجود المثبطات التالية: EIPA، و Philippine MDC أو Wirt manin. ويُعد EIPA مثبطاً لعملية الشرب الخلوي (macropinocytosis) والالتقام الخلوي بوساطة الكافِيولا (caveolae-mediated endocytosis)، بينما يُعد Philippine و MDC و WT menin مثبطات للالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين (clathrin-mediated endocytosis)، والالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين، والشرب الخلوي على التوالي.

كما هو موضح في هذا الرسم البياني، قلل EIPA من نقل الناقلات النانوية anti ICAM المحملة بـ iodine 125 عبر طبقات خلايا CACO 2 الأحادية. بينما لم يؤدِ Philippine MDC و Wirt Menin إلى خفض مستويات النقل مقارنة بحالة التحكم. يشير هذا إلى أن الناقلات النانوية anti ICAM تستخدم الالتقام الخلوي بوساطة الكيميائيات للنقل عبر الخلايا، ولكن ليس النقل الخلوي المرتبط بـ clar أو clathrin أو الماصات الخلوية.

لتقييم النقل عبر الخلايا (Paracellular transport)، تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (tear) أثناء نقل الحوامل النانوية anti ICAM المسمى iodine 1 25 عبر طبقتين أحاديتين من خلايا caco. تظهر قيم tear في غياب الحوامل النانوية كعناصر تحكم، ويشير الفاصل المتقطع إلى الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). وقد استُخدم بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 5 millimolar كعنصر تحكم إيجابي لفتح الوصلات بين الخلوية، وهو ما انعكس في انخفاض قيم tear إلى المستويات الأساسية.

بالإضافة إلى ذلك، تم قياس وحساب تسرب البروتين عبر الخلايا، والذي تم تحديده بمعامل النفاذية الظاهري لـ iodine 1 25 albumin أثناء عبوره طبقة الخلايا الأحادية في حالة غياب أو وجود 5 millimolar من hydrogen peroxide، أو IgG nano carriers، أو anti ICAM nano carriers؛ حيث أدى hydrogen peroxide إلى تعزيز تسرب iodine 1 25 albumin بشكل ملحوظ إلى الحجرة القاعدية الجانبية، وعمل كضابط موجب كما هو موضح في هذه الرسوم البيانية. ولم يؤدِ التحضين مع anti ICAM nano carriers إلى تغيير تسرب iodine 1 25 albumin عبر الخلايا على مدار 48 ساعة، وذلك بشكل مشابه لـ control IgG nano carriers التي لا يتم نقلها.

تستبعد هذه النتائج النقل عبر الخلايا (paracellular transport)، وتتوافق مع النتائج السابقة التي تشير إلى أن الناقلات النانوية المضادة لـ ICAM تستخدم عملية الالتقام الخلوي بوساطة CAM للنقل عبر الخلايا (transcellular transport). عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم اختيار نوع واحد أو أكثر من الخلايا المناسبة، ومرشح نفاذ بقطر مسام ومادة مناسبين، وما إلى ذلك لنظام Transwell، بالإضافة إلى تقنيات وسم لضمان التقدير الكمي الفعال لنظام توصيل الدواء الخاص بك بعد هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى مثل الفلورة أو المجهر الإلكتروني النافذ لتحديد موقع المواد المنقولة، وبالإضافة إلى ذلك للتحقق من حالة المواد المنقولة.

يمكن استخدام تقنية لطخة وسترن (Western blot) لقياس تحلل البروتين. كما يمكن استخدام مقايسة الامتصاص المناعي الإنزيمي في الموقع (EISA) لتحديد قدرة الناقلات المنقولة على الاستهداف، ويمكن قياس نشاط الحمولة الدوائية باستخدام مقايسات القياس الطيفي الضوئي أو تقنيات أخرى مناسبة.