Name: ارتفاع القرار جبل بأكمله في الموضع التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: تعلم تقنية التهجين الموضعي الكامل في أجنة سمك الزرد لتحليل التعبير الجيني المكاني والزماني. تُحسّن هذه الطريقة كشف النسخ المنخفضة الوفرة مع تقليل الإشارات الخلفية غير المحددة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

لقد قمنا بتطوير أساليب محسنة لتصور الحمض النووي الريبي مع ارتفاع القرار. الإجراءات في الموقع التهجين تتم باستخدام بسيطة سلال مصنوعة خصيصا مع قيعان مسامية (الشكل 1). تتم معالجة الأجنة باستخدام حلول ريبونوكلياز خالية في 6 لوحات جيدا في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف معقمة. يتم إجراؤها على فصل الأجنة سلال من مختلف أنابيب إيبندورف الملونة. وتستخدم سلال مع أو بدون حافة لسهولة التوجه والتعرف على ا...

برزت الزرد (دانيو rerio) كنموذج حيوان قوية لدراسة تطوير الفقاريات، والمرض، والسلوك، والمخدرات في فحص 1-3. ويمكن الحصول على الأجنة الزرد بأعداد كبيرة من معبر واحد. الإخصاب والتنمية يحدث الرحم السابقين والأجنة واضحة بصريا تتطور بسرعة. تحدث أحداث التنموية الهامة خلال أول 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF). وهذا يشمل ظهور الجهاز براعم وبدء تمايز خلوي. ويمكن تحقيق ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن البروتينات من خلال Microinjection من الأجنة مع العقاقير morpholino (MO) [أليغنوكليوتيد أو مرنا على التوالي في مرحلة خلية واحدة أو اثنتين (0.75 HPF). رغبة الأجنة الزرد يسهل الدراسة للتعبير المكانية والزمانية لجينات معينة من الفائدة. تطبيق تقنية WISH بعد Microinjection من الأجنة مع مرنا أو MO إلى الإفراط في EXPRوفاق سطيف أو مستويات بروتين معين ضربة قاضية يكشف تنظيم الفرق من الجينات الأخرى. التغيرات في أنماط التعبير الجيني يمكن ربط مع التغيرات المظهرية وتكشف عن وظيفة الجينات المستهدفة خلال توالد الأعضاء في وقت مبكر. منذ تحقيقات يمكن إعداد وتخزينها في وقت مبكر، ويمكن تطبيق هذه التقنية ISH للكشف عن أنماط التعبير الجيني لا يقل عن 20 جينات في وقت واحد باستخدام لوحات ستة جيدا والعرف سلال مصنوعة.

<table><tbody>طقم استنساخ <tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA - مروج مزدوج pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ طقم تنقية البلازميد الصغير</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 و HindIII إنزيمات التقييد</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025 ، 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>الفينول المشبع العازل ،</td><td>15513039</td><td>Invitrogen</td> عالي النقاء <td>يحفظ عند 4 درجات مئوية. العينين والجلد والجهاز التنفسي مهيج ومشتبه في أنها مادة مسرطنة. يجب توخي الحذر أثناء المناولة.</td></tr><tr><td>الكلوروفورم</td><td>فيشر</td><td>C607-1</td><td>مادة مسرطنة سامة ومشتبه بها. العمل تحت غطاء الدخان.</td></tr><tr>DNAse I <td>Roche</td> <td>الخالي من RNase</td><td>4716728001</td><td>قم بإعداد كميات صغيرة وتخزينها عند -20 درجة مئوية.</td></tr><tr><td>مزيج وضع العلامات DIG-RNA مع Sp6 و T7 و T3 RNA Polymerase</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.5)</td> <td>فيشر</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100٪ إيثانول</td><td>كحول</td><td></td><td></td>تجاري</tr><tr><td>ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)</td> <td>سيجما</td><td>40718-25 مل</td><td>DEPC هو مهيج للعين والجلد والجهاز التنفسي. تجنب ملامسة الجلد والعينين. استخدم نظارات السلامة والقفازات والقناع.</td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>فيشر</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 م (درجة الحموضة 8.0)</td><td>فيشر</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>أنظمة أحواض السمك</td> الفورية<td>لملح المحيط</td><td>غير متوفر / A</td><td></td></tr> محلول <tr><td>ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)</td><td>فيشر</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد (PFA)</td> <td>سيجما</td><td>P6148-1KG</td><td>تحضير وتخزين في -20 درجة ؛ C مثل 40 مل من الحصص للاستخدام لاحقا. PFA سام. استخدم نظارات السلامة والقفازات وقناع الغبار.</td></tr><tr><td>فينيلثيوكاربومايد (PTC)</td> <td>سيجما</td><td>P7629-25G</td><td>PTC شديد السمية. استخدم نظارات السلامة والقفازات وقناع الغبار.</td></tr><tr><td>ميثانول</td><td>فيشر</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>دومون (صانع ساعات) ق) نمط الملقط رقم 5</td><td>أدوات</td><td></td><td></td>العلوم</tr><tr><td>الدقيقة مجموعة ثقافة الخلايا ذات الستة آبار</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>السلال مصنوعة من شبكة النايلون وأنابيب Eppendorf</td><td>التحضير</td><td></td> الداخلي <td>لصنع السلال ، قم بقطع أنابيب Eppendorf (1.5 مل) مع أو بدون حواف لإزالة الطرف المخروطي. قطع شبكة النايلون إلى قطع صغيرة تتوافق مع حجم &nbsp; النهايات المقطوعة لأنابيب Eppendorf. ضع الأنابيب مع شبكة النايلون التي تغطي الطرف المقطوع على كهربائي &nbsp ؛ لوح ساخن حتى يلتصق كل من الأنبوب وشبكة النايلون ببعضهما البعض (يتم تنفيذها في غطاء الدخان). اقطع الشبكة الزائدة من السلال واحفظها في الميثانول بنسبة 100٪ حتى تستخدمها.</td></tr><tr><td>بولي أوكسي إيثيلين أوربيتان مونولورات (توين 20)</td> <td>سيجما</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>بروتيناز K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>أنهيدريد الخليك</td><td>سيجما</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>ثلاثي إيثانول أمين</td><td>سيجما</td><td>90279-100 مل</td><td></td></tr><tr><td>فورماميد ، درجة نقاء عالية</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 راتنج</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>حامض الستريك أحادي الهيدرات</td><td>سيجما</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>ملح الصوديوم الهيبارين</td><td>سيجما</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>عازلة سترات الصوديوم الملحية (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA من نوع الخبازين من نوع الخميرة X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td> <td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N ، N-Dimethylformamide اللامائي (DMF)</td> <td>Sigma</td><td>227056</td><td>مهيج وسام وقابل للاحتراق والماخي المشتبه به. تعامل مع ملابس السلامة المناسبة بما في ذلك القفازات والنظارات الواقية.</td></tr><tr><td>5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل فوسفات (BCIP)</td><td>سيجما</td><td>N6639</td><td>حماية هذا المحلول من الضوء.</td></tr><tr><td>نيتروبلو تيترازوليوم (NBT)</td><td>سيجما</td><td>840 واط</td><td>حماية هذا الحل من الضوء.</td></tr><tr><td>الألبومين من مصل الأبقار ، الجزء المنقى V (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>شظايا الأغنام المضادة للديجوكسيجينين-AP شظايا فاب</td><td>روش</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>سيجما</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96 ألواح زراعة الخلايا الجيدة</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg (mnx1: GFP) ml2 / Tg (hb9: GFP) ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg (mnx1: GFP) ml2</td><td></td></tr><tr><td>أنظمة أكواريوم</td> <td>المحيط الفورية</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

ارتفاع القرار جبل بأكمله<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

تركز هذه المقالة على جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) من الأجنة الزرد في. التكنولوجيا WISH يسهل تقييم التعبير الجيني سواء من حيث توزيع الأنسجة والمرحلة التنموية. وصفت البروتوكولات لاستخدام رغبة الأجنة الزرد باستخدام العقاقير تحقيقات RNA المسمى مع digoxigenin. يتم إنشاؤها من خلال دمج تحقيقات النيوكليوتيدات digoxigenin المرتبطة من خلال نسخ في المختبر من القوالب الجينات التي تم المستنسخة والخطي. تتم إزالة chorions من الأجنة التي تحصد في مراحل نمو محددة قبل الحضانة مع تحقيقات محددة. بعد إجراء الغسيل لإزالة الزائدة التحقيق، يتم تحضين الأجنة مع الأجسام المضادة لمكافحة digoxigenin مترافق مع الفوسفاتيز القلوية. من خلال توظيف ركيزة مولد اللون لالفوسفاتيز القلوية، يمكن تقييم التعبير الجيني محددة. ويمكن تبعا لمستوى التعبير الجيني يتم الانتهاء من الإجراء بأكمله في غضون 2-3 أيام.

باستخدام بروتوكول مع 50 الأجنة في سلة (لكل جين / لكل حالة تجريبية) لا يمكن أن يتحقق هذا النمط من التعبير هذا الجين في تجربة واحدة. تقريبا كل الأجنة تظهر أنماط التعبير مماثلة لجينات معينة. وترد أمثلة ممثل الموقع تلطيخ التهجين في في أرقام 3-6. فقد تم تصنيع كل من العقل ومكافحة الشعور riboprobes من cDNAs المقابلة لPC5.1، PC5.2 6، 7 SCL/tal-1، غاتا-1 8،9، FLK / ...

أصبح الزرد، والأسماك الاستوائية الصغيرة، نموذجا محببا لدراسة وظيفة الجين خلال التنمية الفقاريات والمرض. التعبير الزماني والمكاني من الجينات المستهدفة يمكن تحديده من خلال<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين. لدينا تحسين بروتوكول يسمح للكشف عن انخفاض النصوص وفيرة مع إشارة الخلفية غير محددة منخفضة.

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم التعبير الزمني المكاني لجينات معينة ذات أهمية داخل أجنة أسماك الزرد المرحلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء مجسات CD NA أولا عن طريق دمج أكسجين الديغو في النيوكليوتيدات المرتبطة باستخدام النسخ في المختبر. بعد ذلك ، يتم حصاد الأجنة في مراحل نمو محددة.تتم إزالة الكوريوم وتخزين الأجنة في الميثانول عند سالب 20 درجة مئوية. ثم بعد الهضم والتثبيت اللاحق ، يتم تهجين الأجنة باستخدام المجسات المناسبة. أخيرا ، يتم تلطيخ الأجنة بجين مضاد وأجسام مضادة والإشارة المطورة بركائز للفوسفاتيز القلوي.في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر توزيع الأنسجة للتعبير الجيني في مرحلة نمو معينة من خلال التهجين والتصوير في الموقع بالكامل. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى أكبر حول التعبير الطبيعي للجين المستهدف ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على حالات أخرى مثل التعبير الجيني المستهدف في نموذج المرض ، وعندما تكون الجينات الأخرى أكثر أو أقل من التعبير. باستخدام تقنية الحقن المجهري باستخدام CDNA للجين ذي الأهمية ، قم بإعداد تفاعل وضع العلامات على الحمض النووي الريبي لتصنيع أكسجين الحمض النووي الريبي في مجسات الحمض النووي الريبي المسمى في قارورة تفاعل حر من الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة واحد إلى خمسة ميكروغرام من الحمض النووي القالب المنقى إلى الماء المقطر المزدوج المعالج بحجم يصل إلى 13 ميكرولترا.قم بتبريد التفاعل على الجليد وأضف الكواشف التالية بعد خلط جهاز الطرد المركزي برفق 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة قبل احتضان التفاعل لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية بعد الحضانة ، قم بإزالة قالب الحمض النووي عن طريق إضافة ميكرولترين من الحمض النووي الريبي الحر. يحتضن الحمض النووي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وتوقف التفاعل بإضافة ميكرولترين من 0.2 مولار EDTA ، ويترسب نواتج التفاعل بإضافة 2.5 ميكرولتر من أربعة كلوريد ليثيوم مولي و 75 ميكرولتر من 100٪ إيثانول. اخلطي المحلول واحتضنه عند سالب 20 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة أو طوال الليل.جهاز الطرد المركزي للتعليق لمدة 30 دقيقة عند 13 ، 000 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية. ثم اغسل الحبيبات بالثلج البارد ، 70٪ الإيثانول بعد الغزل لمدة 10 دقائق. جفف الحبيبات لمدة دقيقتين قبل إعادة التشكيل ، مع تعليقها في 50 ميكرولتر من النوكلياز ، والماء المقطر المزدوج الحر.ثم احتضنها لمدة 30 دقيقة. عند 37 درجة مئوية ، قم بتشغيل ميكرولتر إلى ميكرولتر من المسبار على جل 1٪ aros لمدة 30 دقيقة تقريبا للتحقق من جودته وسلامته. ثم استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد المسبار لإعادة ترطيب الأجنة الثابتة والمجمدة مسبقا.ابدأ بصنع السلال عن طريق قطع الأطراف المخروطية من الأنابيب الدقيقة سعة 1.5 مل. ثم قم بإزالة الحواف العلوية من نصفها. قم بقص قطع صغيرة من شبكة النايلون لتغطية الأطراف ، ثم في عدد قليل من الغطاء ، قم بتسخين نهايات الأنبوب على لوح تسخين كهربائي واضغط عليها في الشبكة بعد أن تبرد.قم بإزالة شبكة النايلون الزائدة وقم بتخزين السلال في 100٪ من الميثانول في درجة حرارة الغرفة. بعد تحضير التخفيف المتتالي للميثانول في PBS ، وفقا لبروتوكول النص وإضافة أربعة ملليلتر من كل منها في آبار طبق بئر بستة بئر ، ضع الأجنة في سلال فردية لكل مسبار واحتضانها في سلسلة PBS الميثانول لمدة خمس دقائق لكل بئر تنتهي بثلاث غسلات في PBST. قم بتجشير الأجنة مع البروتيناز K في درجة حرارة الغرفة ، باستخدام أوقات الحضانة التالية لكل مرحلة من مراحل النمو.ثم قم بإصلاح الأجنة في 4٪ ألدهيد بارافورم في PBS لمدة 20 دقيقة واغسلها في PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط الأستلة وفقا لبروتوكول النص واحتضان الأجنة مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما. ثم اغسل الأجنة و PBST مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.انقل الأجنة إلى أنابيب دقيقة معقمة واحتضانها ب 200 ميكرولتر من خليط التهجين أو HM ، في حمام مائي 70 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. أضف 100 إلى 200 نانوجرام من المسبار إلى المحلول واحتضنه طوال الليل عند 70 درجة مئوية في حمام مائي. استبدل محلول المسبار ب HM الدافئ مسبقا واحتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.بعد وضع العينات من خلال سلسلة H-M-S-S-C وحجب الأجنة وفقا لبروتوكول النص ، قم باحتضان الأجنة في تخفيف واحد إلى 5،000 من الجسم المضاد ل D AP في منع المخزن المؤقت بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف في اليوم التالي. اغسل الأجنة ست مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها. بعد تلطيخ الأجنة ، قم باحتضانها في BCIP و NBT.أضف درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. استخدم مجهر استريو لمراقبة تفاعل التلوين كل 30 دقيقة لإيقاف التفاعل. انقل سلال الأجنة إلى آبار تحتوي على محلول توقف مرتين لمدة 10 دقائق مع تحريك لطيف.بعد تثبيت الأجنة بنسبة 4٪ بارا فورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة. قم بتركيب الأجنة عن طريق نقلها في أقل عدد ممكن من PBS إلى ستة ألواح جيدة تحتوي على 100٪ جلسرين. هز الأجنة برفق في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، صورة بين عشية وضحاها في 100٪ من الجلسرين تحت مجهر استريو.يتم عرض أمثلة تمثيلية على تلطيخ التهجين في الموقع هنا. يمثل التلوين الأرجواني الذي لوحظ بعد التهجين باستخدام مسبار الريبو ذي الأهمية وفرة ومواقع التعبير عن جين معين. على سبيل المثال ، يظهر PC 5.1 تعبيرا منفصلا للغاية داخل الجزء الأمامي والخلفي من الحويصلة الأذنية والخط الجانبي البدائي في 24 ساعة بعد الإخصاب ويتم توطينه بقوة داخل الصواري العصبية الجانبية الأمامية والخلفية بحلول 72 ساعة بعد الإخصاب.في المقابل ، يظهر لك PC 5.2 تعبيرا في كل مكان داخل الجهاز العصبي المركزي مع إقليمية مميزة داخل الحويصلة الأذنية الجسيدية والقناة الفريكية المعرضة ، ويتم التعبير عنها بشكل كبير داخل الكبد والأمعاء بعد 96 ساعة من الإخصاب. يعمل غياب التعبير الجيني عند استخدام مجسات Ribo الحسية المعنية كعنصر تحكم سلبي كما هو موضح هنا. أظهرت تحليلات التعبير عن علامات الدم تلطيخ SCL T واحد داخل الخلايا الجمجمية الثنائية وفي كتلة الخلية الوسيطة أو ICM.على الرغم من أن تلطيخ gata one يظهر أيضا داخل ICM ، إلا أن نمط التعبير مختلف. لوحظ التعبير عن F-L-K-K-D-R-L داخل الأوعية الرئيسية وبين القطاعات في الدماغ الخلفي ، وفي ICM لوحظ تلطيخ القنفذ الصوتي في عدم وجود حبل. في هذه الأمثلة ، يتم توطين التعبير عن DLX اثنين بعد 34 ساعة من الإخصاب في أقواس Talon Cephalon تحت المهاد والأقواس الوسيطة القمجمة و FK D سبعة Fox ، يظهر تعبير واحد بعد 24 ساعة من الإخصاب بشكل رئيسي في صفيحة الأرضية وتعبير HypoChlor.أظهرت أنماط علامات البنكرياس تلطيخ الأنسولين في البنكرياس الغدد الصماء والتربسين في البنكرياس الإفرازي. تؤكد النتائج التي تظهر أنماط التعبير بدقة عالية نجاح البروتوكول المحدد للكشف عن التعبير عن الجينات عالية الوفرة ومنخفضة الوفرة المعروضة. فيما يلي بعض الأمثلة من التجارب التي أجريت في ظل بعض الظروف المثلى.على سبيل المثال ، نتجت إشارة خلفية عالية مع ضعف تعبير القنفذ الصوتي عن عدم كفاية ونفاذية وتهجين بين 55 و 60 درجة مئوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التركيب الكامل في اثنين من التهجين لأجنة أسماك الحمار الوحشي باستخدام مجسات الحمض النووي الريبي المسمى الخندق ، وتلوين ما بعد التهجين والتصوير.

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

جبل بأكمله في الموقع التهجين هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية. هنا ، نقدم قرار عالية الفلورسنت مزدوجة في البروتوكول الموقع التهجين لتحليل نمط التعبير الدقيق لجين واحد وتحديد مجالات التداخل في التعبير عن اثنين من الجينات. نحن تتضمن يوديد النووية propidium مكافحة وصمة عار لتسليط الضوء على تنظيم الأنسجة.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

تثبيت العينة كاملة في الموضع استُخدم التهجين الموضعي في الموقف الكامل (WISH) في مقرر أحياء الفقاريات المقارنة لطلاب المرحلة الجامعية المتقدمة، بالإضافة إلى عمليات تشريح الفقاريات. وقد أتاح ذلك للطلاب فرصة دراسة أنماط التعبير الجيني إلى جانب التشريح العياني، مما ربط بين دراسة البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الكائنات الحية ضمن مقرر دراسي واحد.

جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي

وصفت وسيلة سريعة لإجراء immunostaining القلب الجنينية الزرد. بالمقارنة مع نهج جبل immunostaining كله ، هذا الأسلوب يزيد بشكل كبير من انتشار الأجسام المضادة ، والذي يسمح بالحصول على صور عالية الدقة التي تكشف عن الهياكل الخلوية / التحت خلوية في القلب في غضون فترة زمنية أقل بكثير التجهيز.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

الجنين الزرد هو نموذج ممتاز للبحوث البيولوجيا التطورية. خلال مرحلة التطور الجنيني، الزرد تطوير مع كتلة البيض، الذي يعرض التحديات ثلاثي الأبعاد للمراقبة العينة والتحليل. يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ثنائي الأبعاد جبل الاستعدادات شقة من جبل بأكمله في الموقع (WISH) ملطخة العينات الجنين الزرد.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

موصوفة التقنيات لimmunostain الفوسفات-الحواتم في الأجنة الزرد بأكملها ثم إجراء اللونين متحد البؤر الفلورسنت التعريب في الهياكل الخلوية صغيرة مثل أهداب الابتدائي. يمكن للتقنيات لتحديد والتصوير تحديد الموقع وحركية مظهر أو تنشيط بروتينات معينة.

المناعية الفوسفات-الحواتم في مهدبة هيئات الجامع جبل الزرد الأجنة

أهداب التنمية أمر حيوي ل organogenesis السليم. ويصف هذا البروتوكول أسلوب أمثل التسمية ووضع تصور لخلايا عضو من الزرد.

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

وقد مكنت تقنيات تحرير الجينات الباحثين من توليد طفرات حمار وحشي للتحقيق في وظيفة الجينات بسهولة نسبية. هنا، نقدم دليلا ً لإجراء الجينة المتوازية للجنين والقياس الكمي لإشارات التهجين في الموقع في سمك الحمار الوحشي. ويوفر هذا النهج غير المتحيز دقة أكبر في التحليلات الظاهرية القائمة على التهجين في الموقع.

الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي

توضح هذه المقالة طريقه لتحميل الاجنه الضعيفة الهشة للحصول علي المجهر البؤري المطول الفاصل الزمني. هذه الطريقة منخفضه التكلفة سهله الأداء باستخدام الاطباق المجهرية العادية بالزجاج السفلي للتصوير علي اي مجهر مقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

هنا ، نقدم بروتوكولًا للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية بوساطة البروتينات في الاستعدادات الكاملة لأجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

الحمار الوحشي هو نموذج مهم لفهم نمو الكلى. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في يرقات حمار وحشي والأحداث أثناء تطور الميكسونفروس.

في سيتو التهجين في يرقات حمار وحشي والأحداث خلال تطوير Mesonephros

يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على الصور من خلال الجمع بين التهجين في الموقع والكيمياء المناعية للأقسام الجنينية لأسماك الزرد. تم إجراء التهجين في الموقع قبل التقسيم بالتبريد ، يليه تلطيخ الأجسام المضادة. من المفيد الكشف عن أنماط التعبير عن جينين في الزرد إذا كان هناك ندرة في الأجسام المضادة.

في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية في أجنة الزرد المبردة

تعلم تقنية التهجين الموضعي الكامل في أجنة سمك الزرد لتحليل التعبير الجيني المكاني والزماني. تُحسّن هذه الطريقة كشف النسخ المنخفضة الوفرة مع تقليل الإشارات الخلفية غير المحددة.

ارتفاع القرار جبل بأكمله

استكشف المزيد من الفيديوهات