منهج في التثقيف الجنينية C. ايليجانس خلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو الانفصال والاستزراع في المختبر ، الخلايا الجنينية ، البحرية الأنيقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة كميات كبيرة من القبور أولا. بعد ذلك يتم عزل البيض عن البالغين.

ثم يعالج البيض بالكيتيناز لإذابة قشر البيض. أخيرا ، يتم فصل الخلايا يدويا وطلاءها للزراعة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر التعبير عن علامات خاصة بالخلية من خلال التألق المناعي والفحص المجهري والفيزيولوجيا الكهربية وتقنيات تصوير الكالسيوم.

إثبات الإجراء هو rel ti ، وهو مختبر ما بعد الدكتوراه. بعد زراعة ما لا يقل عن أربع لوحات من أناقة البحر إلى مرحلة GR للبالغين وإعداد الوسائط والحلول وفقا لبروتوكول النص. ابدأ عزل البيض عن طريق وضع أنبوب من محلول مخزون ليكتين الفول السوداني المعد مسبقا.

ضع زلات غطاء الأوتوكلاف في آبار صفيحة 24 بئرا وأضف 200 ميكرولتر من ليكتين الفول السوداني إلى كل غطاء للاحتضان لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استنشق المحلول واستخدم الماء المعقم لغسل الآبار. بمجرد إزالة جميع آثار ليكتين الفول السوداني لمنع تكتل الخلايا.

ثم باستخدام ماء الأوتوكلاف المعقم ، اغسل البالغين GR من ألواح الأجار واجمع التعليق في أنبوبين مخروطيين معقمين سعة 50 مل. ضع الأنابيب على الجليد لمدة تصل إلى خمس دقائق للسماح للديدان بالاستقرار في القاع باستخدام ماصة نقل ، قم بإزالة الماء واستبدله بجهاز طرد مركزي للماء العذب والمعقم. الديدان عند 200 غرام لمدة 10 دقائق.

بعد الغسيل النهائي ، قم بتعليق الديدان في ماء معقم عذب ونقلها إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر قبل الدوران مرة أخرى عند 200 جم لمدة 10 دقائق. إذا لم يتم تكوير الديدان بالكامل ، ضع الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق. بمجرد أن تستقر الديدان تماما ، قم بإزالة الماء وأضف خمسة إلى ستة ملليلتر من محلول التحلل.

ثم قم بهز التعليق برفق لمدة خمس إلى 10 دقائق وكل دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، ضع قطرة من التعليق على زلة غطاء وتحقق من التحلل تحت مجهر استريو. عندما يتم تحلل 72 80٪ من الديدان ، أوقف تفاعل التحلل عن طريق إضافة تسعة ملليلتر من عازلة البيض قبل الدوران من هذه النقطة إلى الأمام ، وأشعل موقد بنسن واحتفظ به لمنع إعادة تلوث البيض ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية واستخدم عازلة البيض لغسل الحبيبات جيدا ثلاث إلى أربع مرات حتى يصبح المحلول صافيا. بعد ذلك ، بعد إزالة المادة الطافية النهائية لفصل البيض عن جثث ، قم بتعليق الحبيبات في ملليلترين من عازلة البيض المعقمة وأضف ملليلترين من 60٪ من السكروز في مخزن البيض.

اخلطي البيض جيدا في المحلول قبل الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة. عند 200 جم ، قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي. سوف يطفو البيض في الجزء العلوي من المحلول.

لذلك ، استخدم ماصة وأطراف معقمة سعة ملليلتر واحد لنقل البيض إلى أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 15 مل. استخدم عازلة البيض المعقمة لغسل البيض ثلاث مرات أثناء العمل تحت غطاء التدفق الرقائقي. لتجنب إدخال التلوث البكتيري ، قم بتعليق البيض المحبب في مليلتر واحد من ملليغرامين لكل مليلتر كيناز ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا.

هز الأنبوب لمدة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اعتمادا على نضارة الإنزيم عندما يتم هضم ما يقرب من 80٪ من قشر البيض. الطرد المركزي للبيض على حرارة 900 جم لمدة ثلاث دقائق. بعد إزالة المادة الطافية بعناية ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط L 15 ، وانقل البيض إلى صفيحة قطرها ستة سنتيمترات وابدأ التفكك اليدوي باستخدام حقنة معقمة سعة 10 مليلتر بإبرة قياس 18.

لمراقبة درجة التفكك ، ضع قطرة من التعليق في طبق بتري طازج واعرضها تحت المجهر. استمر حتى يتم فصل ما يقرب من 80٪ من الخلايا. لإزالة كتل الخلايا والبيض غير المهضوم واليرقة المفرغة ، قم بتصفية المعلق برفق من خلال مرشح خمسة ميكرون وقم بتشغيل أربعة إلى خمسة ملليلتر إضافي من وسط L 15 من خلال المرشح لاستعادة الخلايا لزراعة الخلايا.

بعد الطرد المركزي للمرشح عند 900 جم لمدة ثلاث دقائق ، قام النسخ بتعليق الخلايا في وسط L 15 الكامل الذي تم تشغيله ملليلتر واحد لكل بئر وتخزين الألواح في غرفة رطبة محكمة الغلق عند 20 درجة مئوية في الهواء المحيط. من أجل التفريق بين الخلايا الجنينية المعزولة ، يجب أن تلتصق بالركيزة. تبدأ عملية التمايز بعد حوالي ساعتين إلى ثلاث ساعات من الطلاء وتستمر لمدة 24 ساعة تقريبا.

السمات المورفولوجية في المختبر تشبه بشكل ملحوظ تلك الموجودة في الجسم الحي. على سبيل المثال ، كما هو موضح هنا ، تطور الخلايا العصبية التي تعمل باللمس LM و PLM عمليتين عصبيتين فقط مع إحداهما أطول من الأخرى كما تفعل في الجسم الحي. يشير هذا إلى أن بعض الآليات الجزيئية على الأقل التي تدفع التمايز في خلايا الإليجان مستقلة للخلايا وبالتالي يمكن تلخيصها.

يمكن أيضا ملاحظة علامات البروتين في المختبر والتعديلات اللاحقة للترجمة الخاصة بالخلية في المختبر. على سبيل المثال ، ألفا توبولين هو الخلايا العصبية المشبعة فقط في اللمس في إلجان البحر كما هو موضح هنا في العمليات المختبرية للخلايا العصبية التي تعمل باللمس مع جسم مضاد مرفوع ضد ألفا توبولين مشبع. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو موضح في هذه اللوحة ، تعبر الخلايا العصبية التي تعمل باللمس عن القناة الطافرة السامة MEC four D ، والتي تسبب موت الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في الجسم الحي بالفعل.

GFP التي تعبر عن الخلايا العصبية المحضرة من سلالة MEC four DPE 4G FP موجودة في البداية في الثقافة ، ولكنها تتدهور بعد ذلك. ومع ذلك ، تماما كما هو الحال في الجسم الحي ، يمكن إنقاذ الخلايا من الموت عن طريق العلاج باستخدام IDE و dantrolene كما هو موضح هنا. تستخدم تقنيات مشبك التصحيح لدراسة القنوات المعتمدة على البوتاسيوم ، والأونيك ، وغير الانتقائية ، وناقل الدوبامين في الخلايا المستزرعة في البحر elgan.

نظرا لصغر حجم الخلية ، يجب أن تحتوي الماصات الزجاجية على طرف صغير ثم مخروط عريض لتعويض مقاومة الإدخال المتزايدة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحقيق نجاح أكبر من خلال تطبيق نبضة عالية الجهد على رقعة الغشاء الموجودة أسفل طرف الماصة مقابل الوصول إلى الخلية بأكملها عن طريق الشفط الذي يمكن أن يتلف الخلية. في هذا الشكل لدراسة دور قنوات الكالسيوم ذات الجهد المسور ، يتم استخدام ION four لاختراق الغشاء ومعايرة الخلايا العصبية التي تعمل باللمس التي تعبر عن الحرباء YC نقطتين 12 لتصوير الكالسيوم في غياب الكالسيوم أو وجوده.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد أن متوسط تركيز الكالسيوم الحر في الخلايا العصبية التي تعمل باللمس هو 200 نانو مولار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية العزلة والثقافة في المختبر. انظر الأناقة والخلايا الجنينية.