منهج Decellularization لإنتاج وغير خلوي الطبيعية المعوية ماتريكس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء سقالة طبيعية لا خلوية لهندسة الأنسجة المعوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق القصف الأول ، وهو شريان مساريقي علوي للفئران أو SMA ، وحصاد الأمعاء الدقيقة جنبا إلى جنب مع وصول الأوعية الدموية. في الخطوة الثانية ، يتم غسل الحطام داخل اللمعة ويتم توصيل القنيات داخل اللمعة والأوعية الدموية بمضخة تمعجية.

بعد ذلك ، يتم تغذية الأمعاء الدقيقة بالماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. في الخطوة الأخيرة ، يتم غراء الأمعاء الدقيقة ب deoxy الصوديوم ، والمعطف ، والحمض النووي في درجة حرارة الغرفة. في النهاية ، يمكن تصور إزالة الخلايا الكاملة للأمعاء الدقيقة ، وكذلك بنيتها ومكوناتها عن طريق الأنسجة والفحص المجهري الإلكتروني على التوالي.

نحن نواجه حاليا مشكلة سريرية تتمثل في الفشل المعوي ، وهي حالة مدمرة تؤثر على كل من الأطفال والبالغين. لا توفر تغذية الوالدين والزرع التقليدي علاجا كاملا. يمتد إنتاج سقالة معوية وعائية ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الفيديو التالي ، نحو علاج الفشل المعوي.

ما يلفت النظر في هذه التقنية هو أن استخدام المواد الكيميائية الرقمنة اللطيفة يحافظ على البنية الدقيقة المعوية كما يتضح من نتائج المجهر الإلكتروني. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحفاظ على شبكة الأوعية الدموية الهرمية التي تتبع الحضارة تسمح بذر هيكل يمكن إعادة توصيله بالمضيف. إمدادات الدم ابدأ بتركيب مضخة تمعجية بأبوبين ، ثم قم بتشغيل 70٪ من الإيثانول عبر أنابيب المضخة التمعجية لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة ، متبوعا ب PBS AA المحضر حديثا لمدة 15 دقيقة أخرى.

بعد شطف المضخة رش ومسح بطن الجرذ الدمية spra الذي تم قتله رحيم 250 إلى 350 جرام مع 70٪ من الإيثانول. ثم باستخدام الأدوات الجراحية المعقمة بالأوتوكلاف ، قم بإجراء شق البطن العانة XO على البطن لضمان مجال جراحي واضح لنزع أحشاء الأمعاء الدقيقة إلى الجانب الأيمن من على منشفة ورقية مرشوشة بنسبة 70٪ من الإيثانول. احرص على تبليل الأمعاء باستمرار باستخدام P-B-S-A-A لتجنب جفاف الأنسجة وتمسخ المصفوفة خارج الخلية.

بعد ذلك ، حدد موقع SMA ، الذي ينشأ بزاوية 90 درجة من الشريان الأورطي باتجاه الأمعاء. ضع خياطة حول ضمور العضلات الشوكي وقم بإعداد عقدة. استخدم قنية قياس 27 لدخول SMA من الشريان الأورطي ، ثم اسحب الإبرة بسرعة لتجنب تمزق جدار الوعاء.

الآن قم بإدخال الأنبوب البلاستيكي للقنية إلى SMA ، وقم بتأمين الأنبوب باستخدام خيوط Vicryl five oh ، ثم قم بحقن 10 ملليلتر من P-B-S-A-A لتأكيد القنية. بعد ذلك ، استخدم المقص لشق الشريان الأورطي القريب والبعيد عن ضمور العضلات الشوكي لتحرير القنية لتجنب تسرب البراز عند تشريح الأمعاء الغليظة ، ضع عقدة خياطة حريرية واحدة على الطرف القريب من الوصلة اللفائفية وواحدة في الطرف البعيد من القولون السيني. ثم قم بقطع الدقاق الطرفي والقولون بين العقدتين وإزالة الأمعاء الغليظة.

الآن قم بقطع الأمعاء الدقيقة عند تقاطع جونو الاثني عشر وتحرير الأمعاء من أي اتصالات للنسيج الضام قد تكون لها مع البطن. انقل الأمعاء الدقيقة إلى طبق بتري يحتوي على PBS aa. ثم استخدم ماصة بلاستيكية خلفية لقنية الجزء القريب من الأمعاء ، وتثبيته في مكانه بالغرز.

أخيرا ، قم بقص الماصة بحيث تناسب قفل الإغراء لمحقنة سعة 60 مليلتر ، ثم اغسل تجويف الأمعاء بغسلتين سعة 60 مل من P-B-S-A-A لإزالة أي براز وحطام قبل البدء في عملية إزالة الخلايا ، تأكد من عدم وجود فقاعات داخل تجويف الأمعاء والقنيات الوعائية. ثم قم بتوصيل قضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات بالقنية الوعائية وضع طبق بتري في وعاء لجمع أي محلول فائض. بعد ذلك ، ابدأ في تشغيل الماء منزوع الأيونات من خلال مضخة الأسطوانة ذات السرعة المتغيرة LS المرنة الرئيسية بسرعة 0.6 مل في الساعة.

تعامل مع الأنسجة بعناية لضمان خروج الفقاعات من الطرف البعيد. بمجرد إزالة جميع الفقاعات من القنيات ، انقل الجهاز إلى الغرفة الباردة. ثم ابدأ عملية إزالة الخلايا عن طريق حشد كل من تجويف الأمعاء وشجرة الأوعية الدموية بالماء منزوع الأيونات الجاري لمدة 24 ساعة بمعدل 0.6 مل في الساعة خلال الساعة الأولى.

افحص الجهاز بانتظام للتأكد من أن جميع التوصيلات آمنة. التسرب ضئيل ولا توجد فقاعات داخل الأمعاء. بعد 24 ساعة ، انقل جهاز إزالة الخلايا مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة.

يجب أن يتغير لون الأمعاء إلى اللون الوردي الفاتح تحت غطاء الشفط. قم بوزن ما يكفي من طبقة ديوكسي الصوديوم لعمل محلول 4٪ في 300 مل من الماء منزوع الأيونات. استخدم دوامة لخلط المحلول حتى يصبح واضحا.

الآن ، استبدل المحلول منزوع الأيونات بتجميع ديوكسي الصوديوم. تحقق من الاتصالات. قم بإزالة أي فقاعات وقم ببث الأمعاء الدقيقة بمعدل 0.6 مل في الساعة لمدة أربع ساعات.

بعد خطوة تجميع ديوكسي الصوديوم ، تصبح الأنسجة شفافة. تظهر صيانة شبكة الأوعية الدموية أيضا بعد إضافة PBS AA إلى المضخة. اغسل الأمعاء باستخدام PBS AA لمدة 30 لتجنب أي تفاعلات بين مزيل أوكسي الصوديوم والطبقة والحمض النووي.

ثم قم بتنقيم الأنسجة بالحمض النووي المحضر حديثا ، أحدهما في درجة حرارة الغرفة بسرعة 0.6 مل في الساعة. بعد ثلاث ساعات ، انقل السقالة إلى غطاء لزراعة الأنسجة وباستخدام تقنية الصرف الصحي ، قم بتغيير اللوحة. أعد تعقيم أنبوب المضخة التمعجية عن طريق تشغيل الإيثانول من خلال.

اغسل الأمعاء للمرة الأخيرة باستخدام P-B-S-A-A لمدة 30 دقيقة لضمان إزالة جميع بقايا محاليل إزالة الخلايا. أخيرا ، انقل السقالة إلى رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية وقم بتشغيل دورتين للتعقيم. ثم قم بتخزين السقالة في P-B-S-A-A.

تغيير المحلول كل ثلاثة أيام. عند إزالة الخلايا بنجاح ، يجب أن يكون للسقالة مظهر عياني مشابه لمظهر الأمعاء الأصلية ، ولكن بجدران شفافة. يجب أن يتضح الحفاظ على العمارة الكلية أيضا من خلال سالكية شجرة الأوعية الدموية.

عندما يتم حقن الصبغة من خلال قنية SMA ، يجب أن تتوزع بالتساوي في جميع أنحاء السقالة وتصل إلى الشجرة الشعرية. يجب أن تكون السقالة خالية من المواد النووية والسيتوبلازمية ، وهو أمر يمكن تقييمه. باستخدام مجموعة قياس كمية الحمض النووي والتحليل النسيجي البسيط ، يجب أن يظهر تلطيخ الهيماتين والإيوين عدم وجود مادة نووية وسيتوبلازمية مع الحفاظ على طبقات الأمعاء الدقيقة كما هو موضح في هذه الصورة.

على وجه الخصوص ، يجب أن تكون صيانة الزغابات والقروح على الجانب اللمعي واضحة بعد الفحص المجهري الإلكتروني الماسح. يجب أيضا توقع مزيد من الحفاظ على مكونات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين والإيلاستين وجليكان أمين الجليكان كما هو موضح هنا. على سبيل المثال ، يسمح تلطيخ Massen Tri CHRO بإظهار النسيج الضام السليم في السقالة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء سقالة معوية خلوية طبيعية.