Name: تلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس عن طريق تجميد تكسير (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: تعلم تقنية تجميد تكسير لصباغة الأجسام المضادة في C. elegans مع تقليل المعالجة الكيميائية. تُحسّن هذه الطريقة توطين البروتينات في علم الأعصاء وعلم الأحياء الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم توفير التمويل من قبل جبهة الخلاص الوطني CCLI # 0633618 وجامعة ولاية أوهايو. وقدمت بعض سلالات من مركز علم الوراثة انواع معينة. يظهر طالب دراسات عليا Reetobrata باسو في الفيديو.

<ol><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoulin%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Duerr, J. S. Immunohistochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuerr%2C+JS+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth%2C+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li>
<li>Miller, D. M., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+DM+%22Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press. San Diego, California. 365-394 (1995).</li>
<li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li>
<li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos%2C+larvae%2C+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li>
<li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li>
<li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Using+Antibodies%3A+A+Laboratory+Manual%22">Using Antibodies: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1999).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22WormBook%22">WormBook</a>. , WormBook. (2006).</li>
</ol>

يعلن المؤلف أنه ليس لديها مصالح مالية المتنافسة.

بروتوكول تكسير تجميد هي واحدة من عدة طرق لتلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس. وهو يوفر وسيلة بسيطة نسبيا وصمة عار الديدان، ولكن لا تتطلب الكواشف محددة وممارسة لأفضل النتائج. الخطوات الحاسمة (المبين في الشكل 1) ما يلي: 1) إعداد الشريحة (انظر الخطوات 1 و 2) ضغط يدوي من الديدان الخيطية (انظر الخطوات 2 و 3) التثبيت السريع (راجع الخطوة 3). أولا، لتحقيق أقصى قدر من الالتصاق من الديدان الخيطية على الشرائح، فمن الأفضل لإعداد الشرائح مع ارتفاع الوزن الجزيئي (بول...

لتحديد توطين الخلوية والتحت خلوية من البروتينات، والعلماء وصفت تقليديا الأنسجة مع الأجسام المضادة المحددة للاعتراف على وجه التحديد خاصة البروتينات 1. في بعض الكائنات الحية مثل نموذج C. ايليجانس، وكثيرا ما تم استبدال تلوين الأجسام المضادة عن طريق التقنيات الوراثية الجزيئية، والتي تسفر عن نتائج بسرعة أكبر. وتشمل هذه الكائنات مع تحويل بنيات تتكون من اندماج الجينات بين المروج والمناطق الترميز من الجينات في المصالح وبروتين الفلورية الخضراء. ومع ذلك، والتقنيات الجزيئية تخضع لعدد من الأعمال الفنية، بما في ذلك المشاكل مع معرفة المروج الحقيقي والتغيرات في التعبير عن ثوابت في عدد نسخ عالية (التقنيات المعتادة في C. ايليجانس) 2،3. وبالتالي، وتلطيخ مع الأجسام المضادة لا تزال هدفا للعديد من العلماء دراسة وظيفة البروتين في الجسم الحي. يمكن تلطيخ الأنسجة مع الأجسام المضادة يكون صعبا، إذ أنtibodies قد تعترف فقط المستضد خاصة في التشكل 1. على سبيل المثال، قد الأجسام المضادة تعترف فقط المستضد التشويه والتحريف أو سليمة ثابتة بطريقة معينة وقد لا تتعرف على المستضد في الموقع. وتتفاقم مشكلة تلوين الأجسام المضادة في الديدان الخيطية من حقيقة أن بشرة من الديدان الخيطية يشكل حاجزا غير منفذ نسبيا، ومنع وصول الأجسام المضادة للأنسجة. هناك العديد من الطرق المختلفة المستخدمة لتلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس (إعادة النظر في عملنا السابقة 4). وصمة عار على حالها &quot;الديدان&quot;، وقد وضعت وسائل لتجميد وذوبان الجليد في تثبيتي الصعب نسبيا (الفورمالديهايد أو غلوتارالدهيد)، وتجميد أذاب دورات مساعدة للقضاء على بشرة للسماح الاختراق السريع من تثبيتي 5. بعد التثبيت، تم permeabilized بشرة للسماح الاختراق من الأجسام المضادة، وشملت أساليب العلاج مع الاختزال، كولاجيناز، أو كليهما 5-7. هذه رreatments الحفاظ على التشكل، ولكن في كثير من الأحيان انخفاض أو تدمير الاعتراف الأجسام المضادة. وتشمل الطرق البديلة تشريح 8 للسماح اختراق الأجسام المضادة. &quot;تكسير تجميد&quot; هي طريقة واحدة للوصول إلى المناطق الداخلية من دودة شبه سليمة للسماح الضد تلطيخ 9-10. تجميد تكسير يمكن القيام بها مع مجموعة متنوعة من الظروف التثبيت مع تجنب العلاجات كولاجيناز والحد منها. يتم وضع الديدان الخيطية بين اثنين من المواد اللاصقة والشرائح، والمجمدة، ومن ثم يتم فصل الشرائح، وترك معظم الديدان الخيطية على الشريحة السفلي وجزء كبير من إهاب على الشريحة العليا. يمكن وضعها في أسفل الشريحة تثبيتي، ويتم نقل الشريحة بأكملها مع الديدان الخيطية الالتزام من خلال إجراءات تلوين الأجسام المضادة. طريقة يفعل الحاضر اثنين صعوبات كبيرة. الأولى، فإنه من الصعب تطبيق المبلغ الصحيح من الضغط اللازم لتقسيم النيماتودا دون تشويه جدية منهم. الثانية، فإن العديد من الديدان لا سوف قوضع علامة على أي شريحة، وسيتم فقدان في تثبيتي أو يشطف. ومع ذلك، مع الشرائح والممارسة السليمة، فإن طريقة تسفر بسرعة الديدان الخيطية مع التشكل معقولة والتي يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من مثبتات والأجسام المضادة. طريقة قد تختلف قليلا، وهذا يتوقف على الهدف من المجرب. إذا كان المطلوب تلطيخ من الديدان الخيطية واحد (على سبيل المثال لتحديد ما إذا كان المحولة واحدة غيرت تلوين الأجسام المضادة)، ثم ينزلق مع التصاق القصوى (ولكن أعلى تلوين الخلفية) يمكن استخدامها، مثل الشرائح المعدة المختبر مع متعدد الليزين إضافية (انظر أدناه). لالفورمالديهايد أو غلوتارالدهيد التثبيت، أعلى الشرائح التصاق (شرائح متعدد الليزين، أعد المختبر) وينبغي أن تستخدم، منذ الديدان الخيطية التمسك أكثر قليلا للمتعدد الليزين بعد هذه التثبيتات. إذا كان يتم إصلاح البرية من نوع الديدان الخيطية مع الميثانول و / أو الأسيتون، ثم ينزلق مع انخفاض التصاق وينبغي أن تستخدم أقل تلوين الخلفية (تجارية أو لترaboratory-أعدت الشرائح). إذا كان يتم استخدام مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ومثبتات في المختبر، ومجموعة مختارة من الشرائح قد يكون مستعدا في وقت مبكر وتخزينها لحين الحاجة إليها. بعد أن تم تمكنت من الوصول إلى أنسجة الديدان الخيطية والإجراءات تلوين الأجسام المضادة اتباع الأساليب القياسية (مع حضانات يعد سمة من سمات الأنسجة بدلا من الخلايا 1،11).

<table><tbody><tr><td>شريحة بولي L-lysine (ماركة ESCO)</td><td>Fisher</td><td>12-545-78</td> شرائح <td>العلامة التجارية Sigma مناسبة أيضا</td></tr><tr><td>بولي L-lysine هيدروبروميد</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td>IMPORTANT: < / قوي> العلامة التجارية والوزن الجزيئي العالي للبوليسين الحرجة</td></tr><tr><td>شرائح حافة بلوري واحدة</td><td>فيشر</td><td>48312-002</td><td>العلامات التجارية الأخرى مناسبة</td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td>TOXIC ، ارتد قفازات وقناع أثناء وزن المسحوق لصنع مخزون بنسبة 10٪. ارتداء القفازات عند أنابيب محلول</td></tr> مخزون <tr><td>كوبلن جرة تلطيخ</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td>العلامات التجارية الأخرى مناسبة</td></tr><tr><td>5 شرائح بريد</td><td>إلكتروني علم المجهر</td><td>71549-01</td><td>واحدة من العديد من العلامات التجارية المختلفة لحامل الشرائح الصغير ، ومناسبة لتلوين</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td><قوي>هام: < / قوي> محاليل الفورمالين العادية (37٪ فورمالديهايد) ليست مناسبة. إما 1) قم بإذابة الكريساتالين بارافورمالدهيد في مخزن الفوسفات وتخزينه في كميات صغيرة مجمدة. أو 2) شراء درجة الفحص المجهري الإلكتروني بارافورمالدهيد في الاقتباسات. قفازات سامة - ارتداء القفازات. تخلص من الحوض الزائد بالماء.</td></tr><tr><td>محلول الجلوتارالديهايد ، 25٪ في الماء</td><td>Sigma</td><td>G 5882</td><td><قوي>هام: < / قوي> شراء الجلوتارالديهايد المجهري الإلكتروني في الأمبولات ؛ قفازات سامة - ارتداء القفازات. تخلص من الحوض الزائد بالماء.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>EM-9410</td><td>العلامات التجارية الأخرى مناسبة</td></tr><tr><td>مصل الأبقار ألبومين</td><td>فيشر</td><td>ICN820451</td><td>العلامات التجارية الأخرى مناسبة</td></tr><tr><td>مصل الحمار ، المجفف بالتجميد</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td>العلامات التجارية الأخرى مناسبة</td></tr><tr><td>Cy3 Donkey المضاد للفأر IgG متعدد الملصقات</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-165-150</td><td>يوصى باستخدام هذه الشركة للحصول على أجسام مضادة عالية الجودة متعددة الملصقات (مستنفدة التقارب). حدد الصبغة والمستضد المناسبين (يستخدم لرفع الجسم المضاد الأساسي). </td></tr><tr><td>ن-بروبيل غالات</td><td>فيشر</td><td>ICN10274750</td><td>العلامات التجارية الأخرى مناسبة</td></tr><tr><td>DAPI ، 4'،6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>D 9542</td><td>TOXIC. ارتد القفازات وقم بالاستغناء عن الأجزاء الصغيرة وقم بتقليل التعرض</td></tr><tr><td>Whatman # 1 مرشحات قطرها 15 سم</td><td>فيشر</td><td>09805G</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip # 1 1/2 مستطيل 24 × 60 مم</td><td>VWR</td><td>48393-252</td> <td># 1 1/2 سمك بصريا أفضل</td></tr><tr><td>مجلد شرائح مجهر</td><td>VWR</td><td>48429-092</td><td>ماركات أخرى مناسبة</td></tr></tbody></table>

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; c. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

وصمة عار C. ايليجانس مع الأجسام المضادة، لا بد من تجاوزها بشرة منيعة نسبيا بالطرق الكيميائية أو الميكانيكية. &quot;تكسير تجميد&quot; هو أسلوب واحد يستخدم لسحب جسديا بشرة من الديدان الخيطية الديدان الخيطية عن طريق ضغط بين شريحتين ملتصقة، تجميدها، وسحب الشرائح على حدة. يوفر تجميد تكسير وسيلة بسيطة وسريعة للوصول إلى الأنسجة دون المعالجة الكيميائية، ويمكن استخدامها مع مجموعة متنوعة من مثبتات. ومع ذلك، فإنه يؤدي إلى فقدان العديد من العينات وضغط ميكانيكيا المطلوبة يشوه العينة. مطلوب الممارسة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من العينات مع مورفولوجية جيدة. يمكن أن يكون الأمثل تجميد تكسير لشروط محددة التثبيت، والانتعاش من العينات، أو منخفضة تلطيخ غير محددة، ولكن ليس لجميع المعلمات في آن واحد. عن الأجسام المضادة التي تتطلب شروط التثبيت من الصعب جدا وتحمل العلاجات الكيميائية اللازمة لpermeabilize كيميائيا بشرة، المعاملهقد يكون من المفضل طن من الديدان الخيطية سليمة في الحل. إذا كانت الأجسام المضادة يتطلب الإصلاح أخف وزنا أو إذا كانت الشروط التثبيت الأمثل غير معروفة، ويوفر تجميد تكسير وسيلة مفيدة جدا لفحص الأجسام المضادة بسرعة ويمكن أن تسفر عن معلومات محددة توطين التحت خلوية والخلوية للمستضد من الفائدة.

عندما يتم ضغط الديدان بشكل صحيح، متصدع، وبخفة ثابتة، يمكن تقريبا الدودة بأكمله تكون في متناول تلوين الأجسام المضادة (انظر الشكل 2). موقع نواة كما يتبين من تلطيخ دابي تشير إلى أي أجزاء من دودة سليمة عندما تتعرض الديدان لتثبيتي أصعب، مثل الفورمالديهايد، والتشكل من دودة قد تصبح مشوهة (كما رأينا من قبل ظهور مائج غير طبيعية من العضلات في أرقام 3A-D). مشكلة مشتركة أخرى هي تثبيت متفاوتة أو اختراق أنسجة معينة. ويرد مثال على ذلك في أرقام 3E-H،</str...

&quot;تكسير الفريزر&quot;، وهي طريقة لتعريض الأنسجة الداخلية للC. الخيطية ايليجانس إلى الأجسام المضادة للبروتين التعريب، ويتجلى.

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء صبغ بالأجسام المضادة على ديدان C elegance. وللقيام بذلك، يتم شطف الديدان الخيطية، وتوزيعها على شرائح، وضغطها بعناية بين شريحتين لاصقتين، ثم تجميدها باستخدام الثلج الجاف. بعد ذلك، يتم فصل الشرائح لكسر أجسام الديدان الخيطية ووضعها على الفور في المثبت.تُصبغ الديدان الخيطية بعد ذلك باستخدام تقنيات تلوين الأجسام المضادة القياسية، ويكشف التحليل بواسطة المجهر الفلوري عن تلوين ناجح بالأجسام المضادة للديدان الخيطية شبه السليمة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تثبيت الديدان الخيطية السليمة، في أنها تقلل من المعالجة الكيميائية للعينة. وعموماً، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تحضير الشرائح والديدان الخيطية يتطلب دقة وحرفية في التنفيذ.سيقوم بتنفيذ هذه الإجراءات كل مني ومن RTO Basu، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. لتحضير شرائح الديدان الخيطية (nematodes) للتلوين، ابدأ بوضع قطعة معدنية مسطحة على الجليد الجاف لتبريدها، ثم استخدم الماء المقطر وشطفاً بواسطة ماصة زجاجية. يتم نقل الديدان التي نمت على طبق NGM واحد بقطر 60 مليمتر مع البكتيريا إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مليلتر. يمكن أن تكون الديدان متزامنة في العمر أو مختلطة الأعمار، ولكن تجنب استخدام الأطباق التي تحتوي على العديد من الديدان البالغة التي يصعب كسرها أو الديدان الجائعة، لأن ذلك سيزيد من التفلور الذاتي، وذلك باستخدام نفس الماصة الزجاجية.اشطف الديدان من ثلاث إلى أربع مرات بالماء المقطر لتخليصها من البكتيريا. ثم لجمع الديدان البالغة في الغالب، اتركها على طاولة المختبر لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. وبعد أن تستقر الديدان في قاع الأنبوب، قم بإزالة معظم الماء من الأنبوب، مع ترك كمية من الماء تعادل ضعف حجم الديدان تقريباً، على ألا يقل الحجم الكلي عن 25 µL.قم بتمييز الجانب المطفي من شرائح البولي-لايسين باستخدام حبر غير قابل للمحو، وضع الشرائح على سطح العمل بجانب حاوية الثلج الجاف بحيث يكون جانب التمييز للأعلى. ستعمل هذه الشريحة كشريحة سفلية. جهّز عدداً مساوياً من الشرائح النظيفة غير المعالجة بالبولي-لايسين.تتوفر الشرائح العلوية. بعد ذلك، قم بنقل حوالي 25 microliters من الديدان في الماء باستخدام الماصة إلى شريحة الالتصاق السفلية، وباستخدام جانب طرف الماصة، وزع الديدان فوق مركز الشريحة. اتركها تستقر لمدة تتراوح من 30 ثانية إلى دقيقتين.ستلتصق نهايات الديدان بمجرد ملامستها للشريحة. ويكمن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في منع الديدان من التعرض لتشوه كبير أثناء تنفيذ الخطوات القليلة التالية. وأفضل طريقة لتحقيق ذلك هي التحلي بالصبر، وتجهيز كافة الأدوات مسبقاً، وتجنب تناول الكثير من الكافيين لضمان ثبات يديك.أمسك الشريحة السفلية بيد واحدة، ثم ضع الشريحة العلوية فوقها بحيث تتطابق جميع الأجزاء باستثناء الأجزاء المطلية (المغشاة). يجب أن يعمل السائل على إبقاء الشريحتين متباعدتين قليلاً لضمان احتفاظ الديدان ببعض القدرة على الحركة. تجنب انزلاق الشريحتين فوق بعضهما البعض، لأن ذلك سيؤدي إلى التواء الديدان.بعد ذلك، وباستخدام إبهامي وسبابتي كل يد، اضغط بحذر وبشكل مستقيم إلى أسفل على الشريحة العلوية. عند تطبيق القدر المناسب من الضغط، سوف تتمزق بعض أكبر الديدان الخنثوية عند حافة الشريحة. بينما سيتلامس معظم البالغين واليرقات مع كل شريحة ولكن سيبقون سليمين، قم بوضع الشرائح فوراً وبحذر على القطعة المعدنية الموضوعة فوق الثلج الجاف دون السماح بانزلاقها. في غضون دقيقة واحدة، ستبدو الشرائح متجمدة، ولكن ابقِها هناك لمدة خمس دقائق لضمان تجميدها تماماً.الشرائح الآن جاهزة للتثبيت. في حال عدم المتابعة فوراً، تُحفظ الشرائح في صندوق مُسمى عند درجة حرارة -80 °C لعدة أيام. ويجب استخدامها في غضون أسبوع تقريباً من تاريخ تحضيرها.لا تستخدم الشرائح بعد التخزين لفترات طويلة. يمكن أيضاً تحضير الديدان الخيطية الفردية على الشرائح بطريقة مشابهة لتلك التي عُرضت للتو. ضع قطعة مسطحة من المعدن على الثلج الجاف لتبريدها.بعد ذلك، استخدم ملتقط الديدان لنقل كل نيماتودا على حدة إلى قطرة ماء على طبق NGM لتخليصها من البكتيريا. يجب أن تكون النيماتودا مغذاة جيداً لتقليل التألق الذاتي. وإذا أمكن، كرر عملية النقل إلى نقاط ماء جديدة حسب الحاجة حتى تخلو الدودة من البكتيريا.بعد ذلك، قم بتحضير الشريحتين العلوية والسفلية كما سبق. ثم ضع قطرة من الماء بحجم 5 إلى 10 µL على المنطقة المعالجة بالبولي لايسين في الشريحة السفلية أثناء المراقبة تحت المجهر. استخدم ملقط الديدان لنقل ما يصل إلى 20 دودة إلى قطرة الماء.يجب أن تغوص الديدان لتمس سطح الشريحة اللاصق. بعد ذلك، ضع الشريحة العلوية كما سبق، ولكن دون ضغط مع التأكد من عدم انزلاق الشرائح على الفور. ضع الشرائح على المعدن فوق الثلج الجاف.تُحفظ على الثلج الجاف لمدة تتراوح من 5 إلى 30 دقيقة، ثم يتم الانتقال فوراً إلى عملية التثبيت. لا يمكن تخزين هذه الشرائح للاستخدام لاحقاً. وللتثبيت الخفيف للديدان، ابدأ بوضع جرات الصبغ التي تحتوي على محاليل التثبيت على الثلج لتبريدها لمدة 10 دقائق.المحاليل المطلوبة هي methanol بنسبة 100%، وacetone بنسبة 100%، ومحلول ملحي منظم بالفوسفات. خذ زوجاً من الشرائح السفلية والعلوية من الثلج الجاف، وفصلهما عن بعضهما بسرعة، ثم اغمر الشريحة السفلية فوراً في methanol مبرد بالثلج لمدة دقيقتين، وتخلص من الشريحة العلوية. بعد ذلك، انقل الشرائح من methanol إلى acetone مبرد بالثلج لمدة أربع دقائق.إذا كانت الشرائح تحتوي على عدد كبير من الديدان، فإن معظمها سيسقط في المثبت حتى مع الشرائح المُعدة جيداً. أما إذا كانت شرائح الديدان المنفردة قد أُعدت بشكل صحيح، فيجب أن تظل الديدان ملتصقة. وأخيراً، لشطف المثبت، اغمس الشرائح في الجرة التي تحتوي على PBS.أصبحت الشرائح الآن جاهزة للتلوين لإجراء تثبيت قوي باستخدام الفورمالديهايد أو الجلوتارالدهيد. ابدأ بتخفيف محلول الفورمالديهايد أو الجلوتارالدهيد من درجة الكواشف في PBS للوصول إلى تركيز نهائي يتراوح من 0.5 إلى 4%. يمكن تخزين الحصص في درجة حرارة من -20 إلى -30 درجة مئوية وإذابتها حسب الحاجة. تذكر أن الفورمالديهايد والجلوتارالدهيد سامّان للغاية، لذا يجب ارتداء القفازات والعمل داخل خزانة استرداد الأبخرة.خذ زوجاً من الشرائح السفلية والعلوية من الثلج الجاف وباشر بفصلهما عن بعضهما بسرعة فوراً. ضع الشريحة السفلية التي تحتوي على الديدان في طبق مسطح بغطاء، وتخلص من الشريحة العلوية فوراً، ثم اسحب بواسطة الماصة 200 µL من المثبت فوق مركز المنطقة الموجودة بها الديدان على الشريحة. سيتجمد المثبت جزئياً في مكانه عند ملامسته للديدان، ثم يذوب ليغطي منطقة أكبر من الشريحة.إذا لم تكن الديدان مغطاة بالكامل بالمثبت فوراً وبعناية، أضف المزيد من المثبت باستخدام ماصة دقيقة. لا تسمح للمثبت بالتدفق خارج حافة الشريحة. أضف مناديل مبللة خالية من الوبر ومطوية إلى الطبق للحفاظ على رطوبته.لا تسمح للمناديل المبللة بلمس الشرائح. بعد ذلك، قم بتغطية الطبق بغطاء واتركه لمدة تتراوح من 10 دقائق إلى ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة. بعد اكتمال عملية التثبيت، استخدم ماصة لنقل المثبت الذي يحتوي على الديدان السائبة بعناية إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter. ثم اغمس الشريحة في وعاء صبغ يحتوي على PBS.قم بطرد مركزي للأنبوب الذي يحتوي على الديدان بسرعة عالية لمدة 30 ثانية لترسيبها. اغسل الديدان مرتين باستخدام PBS. ثم ابدأ في صبغها بالتوازي مع الديدان الموجودة على الشريحة.يُعد بروتوكول صبغ الأجسام المضادة مشابهاً للبروتوكولات القياسية لأي نسيج على الشرائح، وهو موصوف بالتفصيل في المستند المرفق. بعد الصبغ، تُنقل الشرائح إلى PBS وتُترك هناك لمدة تصل إلى 12 ساعة عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتثبيت. ولتثبيت الشرائح، تُرفع الشريحة من PBS.استخدم منديلًا خالياً من الوبر لتجفيف الجانب الخلفي، ثم ضعه لفترة وجيزة وبسرعة على منشفة ورقية. ضع حوالي 20 µL من وسط التثبيت فوق الديدان بحيث تكون كميات وسط التثبيت وPBS متساوية تقريبًا على الشريحة.قم بإمالة الشريحة برفق لخلط المحلولين. تنبيه: وسط التثبيت سام. أمسك الطرف المطفي للشريحة.قم بإمالة الشريحة بحيث يتجمع المحلول بالقرب من المنطقة المطلية. ثم ضع إحدى حافتي غطاء شريحة بمقاس 24 by 60 مليمتر على المحلول لتقليل فقاعات الهواء التي تزيد من عملية التبييض وتعيق الرؤية. أنزل غطاء الشريحة برفق.في حال تكون فقاعات، ارفع حافة غطاء الشريحة ببطء، ثم أعد خفضها دون سحبها فوق الديدان. أضف المزيد من PBS إذا لزم الأمر للتخلص من الفقاعات الهوائية.باستخدام منديل خالٍ من الوبر، اضغط على حواف غطاء الشريحة والشريحة بعناية لتجفيف الحافة. يجب أن تكون حافة الشريحة مرئية من جميع جوانب غطاء الشريحة وألا تكون رطبة للغاية. قم بتثبيت غطاء الشريحة بوضع طبقتين إلى ثلاث طبقات من طلاء الأظافر على الحافة.بمجرد إحكام غلق الشريحة وجفافها، قم بتنظيف غطاء الشريحة وخلفيتها ثم ضعها في فجوات حامل الشرائح. يمكن الاحتفاظ بالشرائح المختومة لعدة أيام في درجة حرارة 4 °C أو لعدة أسابيع في درجة حرارة -20 °C للفترات الأطول. نظراً لأن صبغة DAPI للحمض النووي DNA ومعظم الأصباغ الخضراء تتلاشى، أعد إغلاق غطاء الشريطة باستخدام المزيد من طلاء الأظافر حسب الحاجة، خاصة بعد استخدام أي عدسة غمر زيتية.تم جمع الصور التمثيلية التالية باستخدام شرائح تم إعدادها خلال محاولات صبغ الأجسام المضادة الأولى لطلاب المرحلة الجامعية في دورة مختبر بيولوجيا الخلية. تظهر هذه الصورة مثالاً لرؤوس اثنين من الخناث البالغين الذين تم ضغطهم وتكسيرهم وتثبيتهم بشكل خفيف باستخدام الميثانول والأسيتون بطريقة صحيحة. وقد تم وسمهم باستخدام أجسام مضادة وأصباغ متعددة.في هذه الحالة، يكون الدود بالكامل تقريبًا متاحًا للأجسام المضادة. وعند الصبغ هنا، فإن موقع النوى كما يظهر من خلال صبغ DPI يوضح الأجزاء السليمة من الدودة. وعندما تخضع الديدان لمثبت أقوى مثل الفورمالديهايد، قد يتشوه شكل الدودة.يمكن ملاحظة ذلك في هذه الصور من خلال المظهر المتموج للعضلات الموضحة باللون الأحمر. ومن المشكلات الشائعة الأخرى المرتبطة باستخدام المثبتات الأكثر صلابة هي التثبيت غير المتساوي أو التغلغل غير المكتمل في أنسجة معينة. ويمكن رؤية ذلك هنا، حيث تظهر العضلات الموضحة باللون الأحمر مصبوغة في جزء فقط من الدودة.هنا، يشير وجود صبغات أخرى، بما في ذلك DNA، والتي تظهر باللون الأزرق، إلى أن جزءًا من الجسم على الأقل كان موجودًا. يمكن التعرف بسهولة على النمط الناتج عن الصبغ الجزئي من خلال الممارسة، بحيث يمكن تحديد التوزيع الكامل للصبغ حتى لو أظهر أي دودة منفردة صبغًا غير متساوٍ. يتم هنا توضيح المشكلات الشائعة التي تظهر عند استخدام التكسير بالتجميد تحت أي ظرف من ظروف التثبيت.تتمثل المشكلة الأكثر شيوعاً في التواء العينة نتيجة للحركة النسبية للشريحتين. وخلال عملية الضغط هنا، يشير شكل الأنسجة المصبوغة إلى أن جسم الدودة ملتوي خلف البلعوم مباشرة. كما تظهر هذه الصورة مشكلة الصبغ الخلفي الناتجة عن التصاق الأجسام المضادة بطبقة البولي لايسين التي تغطي الشريحة.يمكن تجنب ذلك باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope). يُرجى ملاحظة أنه حتى مع الممارسة، قد يُفقد العديد من الديدان الفردية أو قد تظهر عليها بعض المشكلات الموضحة هنا. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إتمام التحضير والتثبيت في غضون ساعة، بينما يمكن إتمام الصبغ في يوم واحد.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من طرق التثبيت من أجل تحسين الصبغ لأي جسم مضاد وأنسجة محددة.

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وصفنا طريقة لتوطين البروتينات fluorescently المفتاحية في micrographs الإلكترون. يتم ترجمة باستخدام صور 1 مضان المجهري تنشيط الترجمة في أقسام سامسونج. ثم يتم محاذاة هذه الصور لmicrographs الإلكترون من نفس القسم.

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

وفرة من المستقبلات العصبية تتجمع في نقاط الاشتباك العصبي تؤثر تأثيرا قويا قوة متشابك. هذا الأسلوب الكمي المستقبلات العصبية fluorescently المسمى في ثلاثة أبعاد مع قرار واحد في...

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في<em&gt; C. ايليجانس</em

يصف هذا الفيديو تكسير التجميد ، وهي طريقة لجعل أنسجة C. ايليجانس في متناول تلطيخ الأجسام المضادة عن طريق تعطيل البشرة.

تجميد الديدان الخيطية: طريقة لكشف الأنسجة الدودية الداخلية للتلطيخ

نبلغ عن إجراء موجز للتهجين الموضعي (FISH) في الغدد التناسلية والأجنة من Caenorhabditis elegans لمراقبة وقياس التسلسلات المتكررة. لقد نجحنا في ملاحظة وقياس تسلسلين متكررين مختلفين ، وتكرارات التيلومير ونموذج الإطالة البديلة للتيلوميرات (TALT).

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

نقدم طريقة القائم على التصوير المناعي للتوطين المكاني والزماني لإرك نشط في C. تشريح ايليجانس الغدد التناسلية. بروتوكول صفها هنا يمكن تكييفها لرؤية أي إشارة أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، شريطة الضد كاشف مناسب هو متاح.

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

شفافية يمكن الأمعاء C. ايليجانس بمثابة "في فيفو أنسجة دائرة" لدراسة أبيكوباسال الغشاء والتجويف نشوء حيوي على مستوى خلية واحدة وسوبسيلولار أثناء توبولوجينيسيس متعددة الخلايا. هذا البروتوكول يصف كيفية الجمع بين العلامات القياسية والوراثية فقدان لوظيفة [رني/] والنهج المجهري تشريح هذه العمليات على مستوى جزيئي.

الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

هذا البروتوكول يوضح كيفية تعقب إزفاء بروتين النووي تحت الإجهاد الحراري باستخدام بروتين انصهار بروتين (بروتينات فلورية خضراء) فلورية خضراء كعلامة 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وتلطيخ. DAPI تلطيخ البروتوكول بسرعة ويحافظ على إشارات التعريب سوبسيلولار البروتين والتجارة والنقل.

الكشف عن "البروتين التعريب سوبسيلولار الأخضر Fluorescence علامات البروتين" و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي تلطيخ في ايليجانس كاينورهابديتيس

يوضح هذا البروتوكول استخدام فحص ربط القرب للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين في الموقع في خط ج. elegans الجرثومي.

في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في C. elegans Germline باستخدام القرب الربط اساي

يصف البروتوكول التالي تطوير وتحسين سير عمل عالي الإنتاجية لزراعة الديدان والتصوير الفلوري ومعالجة الصور الآلية لتحديد كمام البولي جلوتامين كميا كتقييم للتغيرات في البروتيوستاسيس.

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

هذه طريقة شائعة الاستخدام لتشريح الغدد التناسلية C. elegans متبوعة بصدع التجميد ، والذي ينتج عينات من الخط الجرثومي للتألق المناعي عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة ، أو لتلطيخ DAPI البسيط لتصور الحمض النووي. كان هذا البروتوكول ناجحا للطلاب الجامعيين في مختبر الأبحاث وفي تجربة بحثية جامعية قائمة على الدورة التدريبية.

جيم ايليجانس تشريح الغدد التناسلية وتجميد الكراك للتألق المناعي وتلطيخ DAPI

يمكن أن يوفر الفحص المجهري فائق الدقة نظرة تفصيلية على تنظيم المكونات داخل مجمع المشابك في الانقسام الاختزالي. هنا ، نوضح بروتوكولا لحل البروتينات الفردية لمجمع Caenorhabditis elegans synaptonemal.

الفحص المجهري فائق الدقة للمجمع المشبكي داخل الخط الجرثومي Caenorhabditis elegans

تعلم تقنية تجميد تكسير لصباغة الأجسام المضادة في C. elegans مع تقليل المعالجة الكيميائية. تُحسّن هذه الطريقة توطين البروتينات في علم الأعصاء وعلم الأحياء الخلوي.

تلوين الأجسام المضادة في

استكشف المزيد من الفيديوهات