تلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس عن طريق "تجميد تكسير"

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تلطيخ الأجسام المضادة على أناقة C. للقيام بذلك ، يتم شطف الديدان الخيطية ونشرها على شرائح وضغطها بعناية بين شريحتين لاصقتين ، ثم يتم تجميدهما على الثلج الجاف. بعد ذلك ، يتم فصل الشرائح لفتح الديدان الخيطية ووضعها على الفور في التثبيت.

ثم يتم تلطيخ الديدان الخيطية باستخدام الأجسام المضادة القياسية ، ويكشف تحليل تقنيات التلوين بواسطة الفحص المجهري الفلوري عن تلطيخ ناجح للأجسام المضادة للديدان الخيطية شبه السليمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تثبيت الديدان الخيطية السليمة هي أنها تقلل من المعالجة الكيميائية للعينة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن إعداد الشرائح والديدان الخيطية أمر صعب إلى حد ما لإظهاره.

سيكون الإجراء أنا و RTO Basu ، طالب دراسات عليا من مختبري لتحضير ألواح الديدان الخيطية للتلطيخ ، ابدأ بوضع قطعة معدنية مسطحة على الثلج الجاف لتبريدها باستخدام الماء المقطر وشطف ماصة زجاجية. نمت الديدان على صفيحة واحدة من NGM 60 ملم مع البكتيريا في أنبوب طرود صغير سعة 1.5 ملليلتر. يمكن مزامنة الديدان أو مختلطة الأعمار ، ولكن تجنب استخدام الألواح التي تحتوي على العديد من المهر التي يصعب تكسيرها أو الجوع للديدان ، مما يزيد من التألق الذاتي باستخدام نفس الماصة الزجاجية.

اشطف الديدان ثلاث إلى أربع مرات بالماء المقطر لتحريرها من البكتيريا. ثم لجمع البالغين في الغالب ، دعهم يجلسون على المقعد لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد أن تستقر الديدان في قاع الأنبوب ، قم بإزالة معظم الماء من الأنبوب ، مع ترك حوالي ضعف حجم الماء مثل الديدان ، ولكن ما لا يقل عن 25 ميكرولتر من الحجم الإجمالي.

قم بتسمية الجانب المصنفر من شرائح البولي ليسين بحبر لا يمحى وضع الشرائح على سطح الطاولة بجوار الحاوية مع وضع ملصق الثلج الجاف لأعلى. سيكون هذا بمثابة الشريحة السفلية. احصل على عدد متساو من المعالجات النظيفة غير البوليزين.

أعلى الشرائح المتاحة. بعد ذلك ، ضع الماصة حوالي 25 ميكرولترا من الديدان في الماء على شريحة الالتصاق السفلية ، وباستخدام جانب طرف الماصة ، انشر الديدان على وسط الشريحة. دعهم يستقرون لمدة 30 ثانية إلى دقيقتين.

سوف تلتصق نهايات الديدان عند ملامستها للشريحة. أصعب جانب في هذا الإجراء هو منع الديدان من التشويه الشديد عند القيام بالخطوات القليلة التالية. أفضل طريقة للقيام بذلك هي التحلي بالصبر ، وجعل كل شيء جاهزا للذهاب ، وعدم شرب الكثير من الكافيين حتى تكون يديك لطيفة وثابتة.

أمسك الشريحة السفلية بيد واحدة ، ضع الشريحة العلوية فوقها بحيث تتداخل جميع الأجزاء ما عدا الأجزاء المصقولة. يجب أن يفصل السائل الشرائح قليلا حتى تظل الديدان تتمتع ببعض الحركة. لا تدع الشريحة تنزلق فوق بعضها البعض ، مما يؤدي إلى تحريف الديدان.

بعد ذلك ، باستخدام الإبهام والسبابة لكل يد ، اضغط بعناية لأسفل مباشرة على الشريحة العلوية مع المقدار المناسب من الضغط ، سوف يتمزق عدد قليل من أكبر الخنثى على حافة الشريحة. في حين أن معظم البالغين واليرقات سيتصلون مع كل شريحة ولكنها ستبقى سليمة على الفور وبعناية دون السماح للشرائح بالانزلاق ، ضعها على قطعة معدنية على الجليد الجاف. في غضون دقيقة واحدة ، ستظهر الشرائح مجمدة ، لكن احتفظ بها هناك لمدة خمس دقائق للتأكد من تجميدها تماما.

الشرائح جاهزة الآن للتثبيت. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتخزين الشرائح على الفور في صندوق مكتوب عليه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لعدة أيام. يجب استخدامها في غضون أسبوع أو نحو ذلك بعد صنعها.

لا تستخدم الشرائح بعد التخزين طويل الأجل. يمكن أيضا تحضير الديدان الخيطية الفردية على الشرائح بطريقة مشابهة لتلك الموضحة للتو كما كان من قبل. ضع قطعة معدنية مسطحة على الثلج الجاف لتبريدها.

بعد ذلك ، استخدم عودة الدودة لنقل الديدان الخيطية الفردية إلى قطرة ماء على صفيحة NGM لتحريرها من البكتيريا. يجب تغذية الديدان الخيطية جيدا لتقليل التألق الذاتي. إذا أمكن ، كرر النقل إلى بقع جديدة من الماء حسب الحاجة حتى تصبح الدودة خالية من البكتيريا.

بعد ذلك ، قم بإعداد الشرائح العلوية والسفلية كما كان من قبل. ثم ضع قطرة ماء من خمسة إلى 10 ميكرولتر على المنطقة المعالجة بالبولي ليسين من الشريحة السفلية أثناء المراقبة بالمجهر. استخدم عود دودة لنقل ما يصل إلى 20 دودة إلى قطرة الماء.

يجب أن تغرق الديدان للمس سطح الشريحة اللاصقة. ثم ضع الشريحة العلوية كما كان من قبل ، لكن لا تضغط مع التأكد من عدم انزلاق الشرائح على الفور. ضع الشرائح على المعدن على الثلج الجاف.

يحفظ على الثلج الجاف لمدة خمس إلى 30 دقيقة وانتقل على الفور إلى التثبيت. لا يمكن تخزين هذه الشرائح لاستخدامها لاحقا. لإصلاح الديدان برفق ، ابدأ بوضع برطمانات تلطيخ تحتوي على محاليل تثبيت على الثلج لتبريدها لمدة 10 دقائق.

المحاليل المطلوبة هي 100٪ ميثانول و 100٪ أسيتون ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات. خذ زوجا من الشرائح السفلية والعلوية من الجليد الجاف ، ولفها بسرعة واغمر الشريحة السفلية على الفور في الميثانول المثلج لمدة دقيقتين ، وتخلص من الشريحة العلوية. بعد ذلك ، انقل الشرائح من الميثانول إلى الأسيتون المثلج لمدة أربع دقائق.

إذا كانت الشرائح تحتوي على الكثير من الديدان ، فسوف يسقط معظمها في المثبت حتى مع الشرائح المعدة جيدا. إذا تم تحضير شرائح الدودة المفردة بشكل صحيح ، فيجب أن تظل الديدان ملتصقة. أخيرا ، لشطف المثبت ، اغمس الشرائح في البرطمان باستخدام PBS.

الشرائح جاهزة الآن للتلوين لإجراء إصلاح ثابت باستخدام الفورمالديهايد أو الجلوتارالديهايد. ابدأ بتخفيف محلول الفورمالديهايد أو محلول الجلوتارالديهايد بدرجة الكاشف في PBS إلى تركيز نهائي من 0.5 إلى 4٪ يمكن تخزين Aliquots عند 20 إلى 30 درجة تحت الصفر وإزالة الجليد حسب الحاجة. تذكر أن الفورمالديهايد والجلوتارالديهايد دائما ما تكون شديدة السمية ، لذلك يجب أن ترتدي قفازات وأن تعمل في غطاء الدخان.

خذ زوجا من الشرائح السفلية والعلوية من الجليد الجاف وقم بلفها بسرعة على الفور. ضع الشريحة السفلية التي تحتوي على الديدان في طبق مسطح بغطاء ، وتخلص من الشريحة العلوية على الفور ، وقم بسحب 200 ميكرولتر من المثبت فوق وسط منطقة الشريحة. مع الديدان ، سوف يتجمد المثبت جزئيا في مكانه ، ثم يذوب لتغطية منطقة أكبر من الشريحة.

إذا لم تكن الديدان مغطاة بالكامل بالمثبت على الفور وبعناية ، فأضف المزيد من المثبت باستخدام ماصة دقيقة. لا تسمح للمثبت بالتدفق على حافة الشريحة. أضف مناديل مبللة مطوية خالية من الوبر إلى الطبق لإبقائه رطبا.

لا تسمح للمناديل بلمس الشرائح. ثم غطي الطبق بغطاء واتركيه لمدة 10 دقائق إلى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة بعد اكتمال التثبيت ، واستخدم ماصة لنقل المثبت بعناية مع الديدان السائبة إلى أنبوب سعة 1.5 مل. ثم اغمس الشريحة في جرة تلطيخ تحتوي على PBS.

قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على الديدان بسرعة عالية لمدة 30 ثانية لتكبيلها. اشطف الديدان مرتين باستخدام PBS. ثم انتقل إلى تلطيخها بالتوازي مع الديدان على الشريحة.

يشبه بروتوكول تلطيخ الأجسام المضادة البروتوكولات القياسية لأي نسيج على الشرائح ويتم وصفه بالتفصيل في المستند المصاحب. بعد التلوين ، انقل الشرائح إلى PBS واتركها تبقى هناك لمدة تصل إلى 12 ساعة عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتركيب. لتركيب الشرائح، قم بإزالة شريحة من برنامج تلفزيوني.

استخدم منديلا خاليا من النسالة لتجفيف المؤخرة ثم ضعه لفترة وجيزة على منشفة ورقية بسرعة. ضع حوالي 20 ميكرولترا من وسط التركيب فوق الديدان بحيث تكون هناك أجزاء متساوية تقريبا من الوسط و PBS. على الشريحة.

قم بإمالة الشريحة برفق لخلط الحلين. الحذر تركيب الوسط سام. عقد الحافة بلوري.

قم بإمالة الشريحة بحيث يتجمع المحلول بالقرب من الزينة. ثم ضع حافة واحدة من زلة غطاء مقاس 24 × 60 ملم على المحلول لتقليل فقاعات الهواء التي تزيد من التبييض وتعطل المشاهدة. اخفض زلة الغطاء برفق.

إذا تشكلت فقاعات ، ارفع حافة زلة الغطاء ببطء. ثم دون الانزلاق عبر الديدان ، أعد خفضها. أضف المزيد من PBS إذا لزم الأمر للتخلص من فقاعات الهواء.

باستخدام منديل خال من النسالة ، اضغط على حواف زلة الغطاء وانزلق بحذر حتى تجف الحافة. يجب أن تكون حافة الشريحة مرئية في جميع أنحاء حافة زلة الغطاء ويجب ألا تكون رطبة جدا. أغلق زلة الغطاء وقم بتطبيق طبقتين إلى ثلاث طبقات من طلاء الأظافر على الحافة.

بمجرد أن تصبح الشريحة مغلقة جيدا وجافة ، قم بتنظيف زلة الغطاء والجزء الخلفي من الشريحة وضعها في آبار حامل الشرائح. يمكن الاحتفاظ بالشرائح المختومة أيام عند أربع درجات مئوية أو أسابيع عند 20 درجة مئوية تحت الصفر على مدى فترات أطول. يؤدي تلطيخ الحمض النووي الخفيف ومعظم الأصباغ الخضراء إلى إعادة إغلاق زلة الغطاء بمزيد من طلاء الأظافر حسب الحاجة ، خاصة بعد استخدام أي عدسة غمر بالزيت.

تم جمع الصور التمثيلية التالية باستخدام الشرائح التي تم إجراؤها خلال محاولات تلطيخ الأجسام المضادة الأولى للطلاب الجامعيين في دورة مختبرية بيولوجيا الخلية. تظهر هذه الصورة مثالا على رؤوس اثنين من الخنثى البالغين اللذين تم ضغطهما بشكل صحيح ومتشققهما وتثبيتهما برفق باستخدام أسيتون الميثانول. تم تصنيفها بأجسام مضادة وأصباغ متعددة.

في هذه الحالة ، يمكن للديدان بأكملها تقريبا الوصول إلى الأجسام المضادة. تلطيخ هنا ، يشير موقع النوى كما هو موضح في تلطيخ DPI إلى أجزاء الدودة السليمة. عندما تتعرض الديدان لمثبت أصعب مثل الفورمالديهايد ، قد يتشوه مورفولوجيا الدودة.

يمكن رؤية ذلك في هذه الصور على أنه مظهر متموج للعضلات الموضح باللون الأحمر. مشكلة شائعة أخرى مرتبطة باستخدام المثبتات الصلبة هي التثبيت غير المتكافئ أو تغلغل أنسجة معينة. يمكن ملاحظة ذلك هنا حيث تكون العضلة الموضحة باللون الأحمر ملطخة فقط في جزء من الدودة.

هنا ، يشير وجود تلطيخ آخر ، بما في ذلك الحمض النووي ، الموضح باللون الأزرق إلى وجود جزء على الأقل من الجسم. يمكن تحديد النمط الناتج من التلوين الجزئي بسهولة من خلال الممارسة بحيث يمكن تحديد التوزيع الكامل للتلطيخ حتى لو أظهرت أي دودة واحدة تلطيخا غير متساو. يتم توضيح المشاكل الشائعة التي تواجهها مع تكسير التجميد باستخدام أي حالة تثبيت هنا.

المشكلة الأكثر شيوعا هي التواء العينة بسبب الحركة النسبية للشريحتين. أثناء الضغط هنا ، يشير مورفولوجيا الأنسجة الملطخة إلى أن جسم الدودة ملتوي خلف البلعوم. توضح هذه الصورة أيضا مشكلة تلطيخ الخلفية بسبب التصاق الجسم المضاد بطلاء البوليليسين للشريحة.

يمكن تجنب ذلك باستخدام المجهر متحد البؤر. لاحظ أنه حتى مع الممارسة ، ستفقد العديد من الديدان الفردية أو ستظهر بعض المشكلات الموضحة هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التحضير والتثبيت في غضون ساعة ويمكن إجراء التلوين في يوم واحد.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من طرق التثبيت من أجل تحسين التلوين لأي جسم مضاد وأنسجة معينة.