إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد أعداد كبيرة من الورم الكروي الموحدة التي يتم التحكم فيها. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد لوحات microwell أولا لتجميع الخلايا المراد تشكيلها في المنشطات. كخطوة ثانية ، يتم حصاد ثقافة من نوع الخلية المطلوب ، والتي توفر تعليق الخلية الذي يحدد حجم وتكوين OIDs.

يتم طرد تعليق الخلية في الآبار الصغيرة واحتضانها للسماح للستيرويد بالتشكل بعد الحضانة. الستيرويد الناتجة موحدة للغاية ويمكن جمعها أو زراعتها في الآبار الصغيرة التي تشكلت فيها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكن صنع أعداد كبيرة جدا من الركام الموحد في وقت واحد.

قد يجد الأفراد الجدد في هذه الطريقة أن وقودهم كبير الحجم. من المهم التأكد من أن تعليق الخلية موزع بالتساوي عبر اللوحة ، وأن حاملات الألواح المتأرجحة في Fuge المركزية تتحرك بحرية بحيث تكون القوة متعامدة على السطح. للبدء ، قم بإعداد طبق معقم من البئر الزراعي 400 عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الشطف الخافض للتوتر السطحي الذي يحتوي على كل بئر.

يضمن استخدام الفاعل بالسطح عدم تفاعل الخلايا مع سطح البئر الصغير. لتجنب احتجاز فقاعات الهواء في الآبار الصغيرة ، أضف السائل على جانب واحد واتركه ينتشر عبر السطح بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. بعد إضافة المحلول إلى الآبار ، استبدل الغطاء.

تأكد من أن الدوار متوازن بشكل صحيح قبل الطرد المركزي للألواح لمدة دقيقتين عند 2000 مرة G.To إزالة الفقاعات باستخدام مجهر مقلوب منخفض التكبير ، وتحقق من إزالة الفقاعات من الآبار الصغيرة. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة على الأقل مع الغطاء في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قم بشفط محلول الشطف من الآبار واغسل اللوحة بالماء المعقم أو PBS مباشرة قبل الاستخدام.

لا تدع الأطباق تجف بعد الترميز. ستختلف تفاصيل تحضير الخلية باختلاف نوع الخلية المحدد الذي تتم دراسته. ومع ذلك ، فقد لاحظنا أن هذه الحالة فعالة لمجموعة واسعة من الخلايا ، بما في ذلك الخطوط التي ناقشناها هنا ، بالإضافة إلى الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والعصبية ، والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، والخلايا الليفية ، والخلايا النهائية المفترضة ، والبدائية ، والخلايا اللحمية لتحضير الخلايا ، ابدأ بقارورة T 75 لخلايا HT 29.

استنشق وسط النمو من القارورة ، وأضف ثلاثة ملليلتر من التربسين. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. أوقف هضم التربسين بإضافة ثلاثة ملليلتر من وسط النمو.

انقل الباقي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. ثم من أنبوب سعة 15 مليلتر ، خذ حصة لحساب الخلايا. الطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 200 مرة G أثناء إجراء الطرد المركزي.

عد الخلايا. بعد ذلك ، استنشق خليط ترين المتوسط واستبدله بنمو جديد. وسيط بوحدة تخزين تحددها كثافة الخلية المطلوبة المحسوبة مسبقا كما هو موضح في بروتوكول النص كخطوة اختيارية.

مرر معلق الخلية من خلال مصفاة لإزالة أي كتل. قد يتم إنشاء الكرات الكروية في مجموعة متنوعة من التركيبات المتوسطة ، ولكن يجب إجراء التجارب الأولية باستخدام الوسط الذي تمت فيه زراعة الخلايا. للتمييز بين عواقب الانتقال إلى نظام استزراع ثلاثي الأبعاد وعواقب تغيير التركيب المتوسط ، ابدأ بإضافة 0.4 مل من وسط النمو إلى كل جهاز طرد مركزي للبئر لمدة دقيقتين بمعدل 2000 مرة G.To إزالة الفقاعات باستخدام مجهر مقلوب منخفض التكبير ، وتحقق من إزالة الفقاعات من الآبار الصغيرة.

بعد ذلك ، أضف 0.4 مل من تعليق الخلية بالكثافة المطلوبة إلى الآبار الصغيرة. ثم امزج برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات الهواء في الآبار الصغيرة ، وتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء البئر. للحصول على المنشطات متسقة.

الطرد المركزي للوحة لمدة خمس دقائق في 200 مرة. G ، يجب أن تكون اللوحة متوازنة داخليا وكذلك مع اللوحة الأخرى بحيث يتم توزيع الوزن بالتساوي على جانبي حامل اللوحة. هذا يضمن أن المستويات الذاتية للوحة أثناء الطرد المركزي ، بحيث لا تنشأ تيارات الحمل الحراري وتؤدي إلى توزيع غير متساو للخلايا عبر الآبار الصغيرة.

باستخدام المجهر المقلوب ، تحقق من أن الخلايا قد تجمعت داخل الآبار الصغيرة وأنها موزعة بالتساوي عبر البئر قبل احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. راقب عملية تكوين كروي باستخدام مجهر مقلوب. بعض خطوط الخلايا سوف تشكل الستيرويد المدمجة في غضون 24 ساعات.

قد يستغرق البعض الآخر وقتا أطول. يظهر هنا التقدم من الكتلة إلى التجميع في خلايا HT 29. أصعب جزء من هذا الإجراء هو إخراج المنشطات intex دون إزعاج الهياكل لاستخراج المنشطات من الآبار الصغيرة ماصة صعودا وهبوطا بلطف شديد للسماح للكرويات بالخروج من الآبار الصغيرة.

ثم قم بإمالة اللوحة لشفط خليط الستيرويد المتوسط. استخدم أطراف ماصة الفتحة العريضة للستيرويد بحجم أكبر لتجنب تكسير الستيرويد. بعد استعادة الستيرويد من الآبار الصغيرة ، قم بنقلها إلى ثقافة التعليق عن طريق إخراجها برفق باستخدام ماصة.

بدلا من ذلك ، يمكن الحفاظ على الوردة الشديدة في النوبة مع استبدال متوسط. تعتمد المدة على الحجم الأولي ومعدل النمو ، والذي يحدد الوقت حتى تتفوق على الآبار الصغيرة. حسنا ، تم تشكيلها لاستبدال الوسيط دون فقدان المنشطات.

استنشق الوسط على حافة البئر. باستخدام ماصة المراعي ، اخفض الطرف ببطء حتى يبدأ في سحب السائل من الغضروف المفصلي واتبع الغضروف المفصلي لأسفل أثناء سقوطه. ثم أضف وسيطا جديدا على جدار البئر في نفس المكان.

عند إضافة الوسط الطازج ، تذكر أن تدفع الماصة برفق وتحافظ على طرفها على الحائط لتجنب إزعاج PHE في الآبار الصغيرة. قد تضيع عدد قليل من الستيرويد. ومع ذلك ، إذا تم استنشاق الوسيط دائما واستبداله في نفس الموضع ، فسيظل هذا الرقم صغيرا.

بالمقارنة مع الأعداد الكبيرة في البئر المنشطات من خطوط ورم متعددة من أصول تشريحية مختلفة يمكن استخراجها بسهولة في تعليق. يتم عرض التحكم في الحجم المتسق الذي يمكن الحصول عليه عبر هذه الطريقة هنا مع مجموعات الستيرويد الزي الرسمي للغاية. تحت كل حالة تشكلت من 700 أو 1 ، 500 خلية.

تظهر أيضا الاختلافات الواضحة في السلوك مع خلايا سرطان القولون HT 29 و TE ست خلايا سرطان المريء التي تشكل ستيرويدات معبأة بكثافة مع حدود محددة بشكل حاد. على العكس من ذلك ، تؤدي خلايا سرطان البروستاتا في غطاء لين إلى منشطات أقل تماسكا ذات حدود غير منتظمة. أدت القوى الداخلية الأقوى في الركام الأكثر تماسكا أيضا إلى الانهيار إلى شكل أكثر تناسقا ، حتى أثناء وجودها في الآبار الصغيرة التي تشكلت فيها.

ومع ذلك ، فإن مجاميع غطاء الخط ، خاصة في الحجم الأكبر ، تحتفظ بشكل واضح بالهندسة البارافلزات المربعة للآبار الصغيرة بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه العملية في حوالي ساعة بالإضافة إلى فترة الحضانة المطلوبة للخلايا للالتصاق وصنع السوائل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من أن فقاعات أخرى ، تسافر عبر الآبار الصغيرة قبل إضافة الخلايا.