Name: إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: اكتشف بروتوكولاً فعالاً لإنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية الموحدة الحجم باستخدام لوحات Microwell. تتيح هذه الطريقة للباحثين إجراء دراسات عالية الإنتاجية في علم الأحياء الخلوي وأورام السرطان.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة كالغاري، في ظل بدء المحقق منحة جديدة للدكتور Ungrin.

ملاحظة: هي لوحات Microwell متوفرة في أشكال مختلفة، اعتمادا على النتائج المرجوة. وتظهر المواصفات فضلا عن المبادئ التوجيهية تقريبي للأرقام الحد الأدنى والحد الأقصى من الخلايا التي ينبغي أن تستخدم مع كل شكل في الجدول 1. وmicrowells أصغر تفتق إلى نقطة حادة، وبالتالي ليس هناك حد أدنى حجم، على الرغم من التباين بين الأجسام الشبه الكروية يصبح أكثر أهمية في أحجام أصغر. الإنتاج الروتيني للالكروية من متوسط ​​اقل من 20 خلايا لكل واضح ومباشر 8. لم يتم مدبب حجم أكبر microwell بالكامل، لذلك يحاول تشكيل الأجسام الشبه الكروية من أعداد صغيرة من الخلايا قد يؤدي إلى أصغر الأجسام الشبه الكروية متعددة في كل microwell. بسبب اختلافات طفيفة في خصائص السطح، وإعداد مع الحل السطحي (الخطوة 1.2) ليست اختيارية عند استخدام لوحات AggreWell 400Ex. ويستند هذا البروتوكول على استخدام AggreWell 400 لوحات - لغيرها من الأشكال سلبياتULT الجدول 1. يتم تحديد عدد الخلايا ليتم تحميلها في كل بئر عن طريق ضرب عدد من microwells أنه يحتوي على عدد من الخلايا لتكون متفاوت لكل كروي. على سبيل المثال، لتوليد الأجسام الشبه الكروية من 1000 خلية لكل منهما، يجب أن يتم تحميل كل بئر مع (1،200 مرات الكروية 1،000 خلايا لكل =) 1.2 × 10 6 خلايا. يجب أن تحسب كثافة الخلية نظرا إلى أن الخلايا سيتم تحميلها في حجم 0.4 مل. وذلك لمثال الكروية شكلت من 1000 خلية لكل منهما، 1.2 × 10 6 خلايا في 0.4 مل يترجم إلى كثافة 3 × 10 6 خلايا لكل مل. 1. تستعد لاستقبال خلايا Microwells <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات Microwell هي عقيمة على النحو المنصوص عليه، ويجب إزالة فقط من عبواتها في بيئة معقمة مثل الوزراء للسلامة الأحيائية الصفحي تدفق. ينبغي الحفاظ على العقم في جميع أنحاء البروتوكول. يجب أن يتعرض للخطر العقم، وresterilized الآبار باستخدام الايثانول 70٪ في استخدام المياهالخطوات التالية اختيارية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من الايثانول 70٪ إلى كل بئر غير المستخدمة. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما بخار الإيثانول يجب تتخلل بسرعة أي فقاعات، وإذا كانت هناك أعداد كبيرة قد يكون من المرغوب فيه لإزالتها. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 ز س. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5 دقائق مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الإيثانول. ويمكن الآن أن تغسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني للاستخدام الفوري، أو تجفف الهواء للتخزين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ضمان أن الخلايا لا تتفاعل مع سطح microwell، قد يكون مستعدا باستخدام بالسطح. بشكل عام هومن المستحسن أن تنفيذ هذه الخطوة في البداية، وبعد ذلك مقارنة الكروية ولدت مع وبدون microwells المغلفة بالسطح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من محلول الشطف إلى كل بئر. بعض microwells سوف فقاعات الهواء فخ، على الرغم من أن هذا يمكن أن يخفض بإضافة السائل في جانب واحد، والسماح لها تنتشر عبر السطح، بدلا من إسقاطه عموديا على السطح. استبدال الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة ثلاثين دقيقة على الأقل مع غطاء على في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين لوحات في أربع درجات مع الحل السطحي في الآبار لحين الحاجة إليها إذا محكمة الغلق لمنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني على الفور قبل استخدامها. لا تسمح لوحاتلتجف بعد الطلاء. </li></ol></li></ol> 2. إعداد خلايا ملاحظة: إن تفاصيل إعداد الخلايا تختلف إلى حد ما مع نوع من الخلايا المحددة التي تجري دراستها. ومع ذلك لاحظنا هذه الشروط أن تكون فعالة مع طائفة واسعة من الخلايا، بما في ذلك خطوط مناقشتها هنا، وكذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفئران (ESC)، والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (التوجيهية)، الخلايا الليفية، الأديم البدائية المفترضة، والخلايا اللحمية. استخدمت مجموعات أخرى هذا النظام بنجاح لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك تكون الغضروف من الخلايا الجذعية الوسيطة 9، الجيل موحدة السلائف العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة 10، تحليلات السمية في خلايا الكبد 11 وتقييم تجديد النخاع الشوكي في السلمندر 12. يظهر بروتوكول معين للعمل مع خلايا HT29 هنا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع قارورة T75 الخلايا HT29، المثقف في DMEM+ 10٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة النمو من القارورة، وإضافة 3 مل من التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التربسين الهضم بإضافة 3 مل من النمو المتوسط. اتخاذ قسامة لعد الخلايا ونقل ما تبقى في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الطرد المركزي في التقدم، عد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح التربسين / خليط المتوسطة واستبدالها مع متوسط ​​نمو جديدة، وحجم تحددها كثافة الخلية المطلوبة والمحسوبة أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة من أجل إزالة أي كتل. ملاحظة: ظروف الحصاد خلية سوف تختلف نوعا ما بين السطور. إذا كان البروتوكول تفارق لمثل الركض الخلايا من الفائدة المتاحة، التي ينبغي أن تستخدم كنقطة انطلاق. مع استخدام خطوط الخلايا الحساسة من التربسين قد يؤدي إلى موت الخلايا المفرطة. في هذه الحالات لاحظنا نتائج جيدة باستخدام TrypLE باعتبارها dissociati البديلةعلى كاشف 8. إذا كانت الخلايا تصبح تجمعت خلال التفكك وتفقد قدرتها على البقاء، إضافة إلى الدناز الحل الانزيم قد حل هذه. يمكن خفض أوقات التفكك وتوظيف خطوة سحن لتفريق كتل الخلايا أيضا زيادة قدرتها على البقاء. </li></ol> 3. تشكيل كروي ملاحظة: قد يتم إنشاء الأجسام الشبه الكروية في مجموعة متنوعة من الصيغ المتوسطة، ينبغي إجراء محاكمات ولكن الأولي خارج باستخدام المتوسطة التي كانت الخلايا المستزرعة، للتمييز عواقب التحول إلى نظام الثقافة 3 الابعاد من عواقب تغيير التركيبة المتوسطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 مل من النمو المتوسط ​​إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 2،000 x ج لإزالة الفقاعات. لاحظ أنه من المهم لضمان متوازنة الدوار بشكل صحيح في هذه السرعة قبل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد أزيلت باستخدام مجهر مقلوب منخفضة التكبير، تحقق من فقاعات من microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 ملتعليق خلية في الكثافة المطلوبة (يحسب أعلاه). المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا، دون إدخال فقاعات الهواء إلى microwells. فمن المهم للتأكد من أن الخلايا توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر، من أجل الحصول على الأجسام الشبه الكروية متسقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز. إذا ما كانت لوحة يست على مستوى الذات أثناء الطرد المركزي، قد تنشأ تيارات الحمل الحراري التي تؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للخلايا عبر microwells. لذلك، ينبغي أن تكون متوازنة لوحة داخليا وكذلك ضد لوحة أخرى، بحيث يتم توزيع الوزن بالتساوي على كلا الجانبين من لوحة الناقل. </li></ol> ملاحظة: إذا كان يعتبر دليلا على التوزيع غير المتكافئ الخلية، قد يكون من الضروري تطبيق كمية صغيرة من تزييت إلى النقاط المحورية على الناقل لوحة - التشاور مع الشركة المصنعة للأجهزة الطرد المركزي للحصول على تعليمات. ملاحظة: مرة واحدة وقد تم طرد الخلايا في microwells، فهي المقاومات معقولتانت لغسل الخروج من الاقتراحات بسيطة من لوحة. وينبغي تجنب الحركات المفاجئة التي تؤدي إلى الخوض في المتوسط، ولكن نقل لوحة من أجهزة الطرد المركزي إلى المجهر أو الحاضنة لا ينبغي أن يؤدي إلى تشريد خلية كبيرة. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب، تحقق من أن الخلايا قد تتجمع داخل microwells، وأنها توزع بالتساوي في جميع أنحاء البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر مقلوب، ومراقبة عملية تشكيل كروي. وبعض خطوط الخلايا تشكيل الأجسام الشبه الكروية التعاقد في غضون 24 ساعة، والبعض الآخر قد يستغرق وقتا أطول. يظهر تطور من مجموعة لتجميع الخلايا في HT29 في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة الكروية من microwells ونقل إلى الثقافة والتعليق من النفث بها بلطف مع ماصة. بدلا من ذلك، الحفاظ على الأجسام الشبه الكروية في الموقع مع استبدال المتوسطة 8 - ومدة يعتمد على حجمها الأولي ومعدل النمو، الذي مواطنهالمعهد الوطني للإحصاء الوقت حتى تتفوق على microwells التي تم تشكيلها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليحل محل المتوسطة دون أن تفقد الكروية والمتوسطة نضح على حافة البئر باستخدام ماصة باستور. جلب ببطء غيض أسفل حتى يبدأ في رسم السائل من الغضروف المفصلي، واتبع الغضروف المفصلي على النحو ينخفض. ثم تضاف متوسطة جديدة ضد الجدار جيدا في نفس المكان. قد يتم فقدان بضعة الكروية، ولكن إذا ويستنشق المتوسطة دائما واستبدالها في نفس الموقف، وهذا العدد لا تزال صغيرة بالمقارنة مع أعداد كبيرة في البئر. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720(2011).</li>
<li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-%CE%B2-induced+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337(2011).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li>
<li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li>
<li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li>
<li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li>
<li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li>
<li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li>
<li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li>
<li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739(2011).</li>
<li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760(2012).</li>
<li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li>
<li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
</ol>

الدكتور Ungrin لديه مصلحة مالية في التكنولوجيا AggreWell باعتباره مخترع.

أنشأنا نظاما قد يتم إنشاء أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية موحدة من خطوط الخلايا متعددة من مصادر مختلفة. لدينا حتى الآن لمواجهة خط خلية ملتصقة التي لا تشكل الأجسام الشبه الكروية في ظل هذه الظروف. لاحظنا سابقا في فقدان الخلية السكان عرضة للanoikis 5،8، ولكن حتى الآن لم تنشأ هذه المسألة مع خطوط الورم. هذا النظام هو تحجيم بشكل تعسفي مع مساحة السطح، مع السلوك متناسقة عبر microwells في 24 جيدا وشكل 6 جيدا، وكذلك المفاعلات الحيوية التي تحتوي على النموذج 50،000 microwells كل قيد التطوير في الوقت الحاضر. يجب كروي التماثل يكون مصدر قلق، ويمكن زيادة فترة حضانة في الخطوة 4.8 ليومين أو ثلاثة أيام. ويمكن أيضا أن المحتضنة الكروية لفترة بعد استخراج من microwells لزيادة التماثل، ولكن في هذه الحالة يجب توخي الحذر للحفاظ على كثافة منخفضة بما فيه الكفاية الثقافة، كما الكروية في اتصال مع واحد واي أخرىليرة لبنانية في كثير من الأحيان تندمج في الهياكل الأكبر حجما. لهذا السبب، حرصنا على الحفاظ سابقا الثقافات داخل microwells التي تشكلت المجاميع، مع الحد الأساسي هو حجم كروي. وهذا بدوره هو وظيفة كل من معدل النمو والحجم الأولي 8، وإذا تم التخطيط الثقافة تمديد داخل لوحة microwell، وهذا ينبغي النظر مقدما. وتشمل خيارات لمنع فرط، ينبغي أن يحدث، إما بدءا الكروية أصغر، أو توظيف microwells أكبر من لوحة AggreWell 800. يجب أن تفشل الكروية لزيادة في التماسك مع مرور الوقت، قد يكون سببا محتملا احدة موت الخلية. خاصة في المجاميع أكبر من الخلايا عملية الأيض نشطة للغاية، ويمكن قيود النقل الجماعي على إيصال الأوكسجين والمواد المغذية الضرورية يؤدي إلى نواة نخرية 2 - بالتالي كروي غير متماسكة قد يكون ببساطة نتيجة لموت الخلايا المفرطة. بدلا من ذلك، قياسات cohe الميكانيكيةوقد استخدمت سيون من الأجسام الشبه الكروية لتقييم القوات ملزمة بين الخلايا، في العلاقة مع المحتملة المتنقل من خط خلية معينة 13. سيكون من المثير للاهتمام أن التحقيق في العلاقة بين شكل كروي والمحتملة المتنقل، ربما باستخدام المعلمات المورفومترية مثل الاستدارة ومحيط لنسبة المساحة. بالإضافة إلى التحقيق في الخواص الميكانيكية والمورفومترية من الأجسام الشبه الكروية، والتجمع في النظام microwell يسمح الإنتاج على نطاق واسع من الأجسام الشبه الكروية مختلط تكوينها، تتألف من مزيج من أنواع خلايا متعددة و / أو المواد الحيوية 6،7. تفاعلات الخلايا السرطانية مع أنواع الخلايا الأخرى مهمة لنموذج أكثر عن كثب سلوك الأورام في الجسم الحي 14، وبالتالي فإنه قد يكون من مصلحة لتوليد الأجسام الشبه الكروية من الخلايا السرطانية في تركيبة مع الخلايا الليفية والخلايا البطانية، على سبيل المثال. ويمكن أيضا أن تدمج المجهرية الدقيقة لمختلف المواد الحيوية، ويمكن أن تؤثر على الإنتاج الاجتماعي للموئلخصائص eroid سواء بصورة مباشرة من خلال تفاعلها مع الخلايا 7،15، وكذلك خزانات للإفراج تسيطر عليها عوامل النمو والسيتوكينات في المناطق الداخلية من 16 كروي. إذا كان هناك أي قلق حول العقم، وعلى سبيل المثال عند العمل مع لوحة microwell التي سبق لها أن استخدمت بعض الآبار والتي قد أمضوا بعض الوقت في حاضنة كجزء من التجربة السابقة، يجوز resterilized الآبار مع الايثانول 70٪ في الماء. مرة واحدة وقد تم تشكيل الأجسام الشبه الكروية، كما انها قد تكون مفصولة من الخلايا الفردية المتبقية عن طريق تمرير تعليق على مصفاة الخلية. الخلايا الفردية سوف تمر من خلال، في حين سيتم الاحتفاظ الكروية. إذا اشتبه كروي من سفك خلايا يحتمل المنتشر على مدى ثقافة، قد يكون من المرغوب فيه أن تنفيذ هذا الإجراء عدة مرات - في البداية لإزالة الخلايا الفردية، وبالتالي إلى عزل purifieد السكان من الخلايا المنبعثة من الأجسام الشبه الكروية.

هناك مجموعة متزايدة من الأدلة على أن الخلايا السرطانية تتصرف بشكل مختلف في ثلاث ثقافات الأبعاد مما يفعلون عندما مثقف على البلاستيك، وأن العوامل العلاجية التي تم تحديدها على منصات الأنسجة الثقافة التقليدية قد تفقد فعاليتها عندما انتقلت إلى نظام أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة 1. ولذلك فمن المستحسن أن دراسة سلوك الخلايا السرطانية في ظل هذه الظروف، وذلك لاكتساب نظرة ثاقبة البيولوجيا الكامنة وراءها، وأيضا لزيادة معدل نجاح الانتقال كلاء علاجية جديدة من مرفق الفرز إلى العيادة. نظام واحد نموذجا مفيدا مع تاريخ طويل توظف مجموعات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية المعروفة باسم الورم 1،2 الكروية. من الناحية المثالية، فإن التقنيات لتشكيل كروي يسمح إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية موحدة حجمها وتكوينها يتم التحكم من قبل المجرب. في حين شنقا الإفلات وكذلك لوحة نهج 3،4 قادرون على تحقيق بعض هذه إعادةيتطلبه، الإنتاجية تقتصر عادة، وتوليد أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية يصبح مهمة كثيفة العمالة. وقد وضعنا مؤخرا نظاما لحل تحديات مماثلة في مجال الطب التجديدي 5. توظيف التجميع القسري ضمن سلسلة من المكتظ الآبار ميكرون النطاق (انظر الشكل 1)، وهذا النهج يسمح توليد الأجسام الشبه الكروية من أرقام التعسفي من الخلايا، بما في ذلك مخاليط من أنواع خلايا متعددة 6، فضلا عن إدماج مختلف المواد الحيوية 7. تتشكل الأجسام الشبه الكروية بأعداد كبيرة - الآلاف إلى مئات الآلاف أو أكثر - ويمكن استخراجها مباشرة أو الاحتفاظ بها في microwells التي تشكلت مع تبادل متوسطة لمدة واحد على الأقل 8 إلى اثنين (المراقبة غير منشورة) أسابيع. وبالتالي هي مناسبة هذا النظام بشكل جيد لتوليد أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية الورم موحدة وقابلة للتكرار لتقييم EFFEctiveness من وكلاء انتيتومور رواية أو التحقيقات البيولوجية الأساسية.

<table><tbody><tr><td>AggreWell 400 لوحة</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27845/27945</td><td></td></tr><tr><td>حل الشطف</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>مصفاة الخلية (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px; عائلة الخط: Arial; اللون: # 000000 ؛ لون الخلفية: #ffffff ؛ وزن الخط: عادي ؛ نمط الخط: عادي ؛ متغير الخط: عادي ؛ زخرفة النص: لا شيء ؛ المحاذاة الرأسية: خط الأساس. "> & micro; م < / سبان >)</td> <td>شركة StemCell Technologies Inc.</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-676</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene (EDTA)</td> <td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-660</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12002-212</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA-95042-112</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مقلوب</td><td>VWR / Motic</td> جهاز الطرد المركزي <td>CA19000-610</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R مع ناقلات لألواح الآبار القياسية</td><td>VWR / Beckman</td><td>CABKA99465 ، CABK369704 ، CABK392806</td><td></td></tr><tr><td>خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي</td><td>ESBE / Baker</td><td>BKR-SG603AHEUVSP</td><td></td></tr></tbody></table>

إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات microwell

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

يتم التعرف على نحو متزايد باعتبارها الكروية الورم في المختبر نموذجا هاما للسلوك الخلايا السرطانية في ثلاثة أبعاد. أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من الثقافات ورقة ملتصقة التقليدية، فإنها ألخص أكثر دقة وتعقيد التفاعلات الموجودة في الأورام الحقيقي. من أجل تسخير هذا النموذج لتقييم أفضل لبيولوجيا الأورام، أو فعالية من وكلاء علاجية جديدة، فمن الضروري أن تكون قادرة على توليد الأجسام الشبه الكروية بتكاثر، في الطريقة التي تسيطر عليها وبأعداد كبيرة. ويتكون النظام من مجموعة AggreWell عالية الكثافة من microwells على شكل هرم، الذي يتم طرد تعليق خلايا مفردة. أعداد خلايا تجميع في الجزء السفلي من كل microwell، وعدد ونسبة من أنواع الخلايا متميزة تشارك تعتمد فقط على خصائص التعليق قدم من قبل المجرب. وبالتالي، فإننا قادرون على توليد الأجسام الشبه الكروية الورم من حجم التعسفي وتكوينها معمن الحاجة إلى تعديل منصة تكنولوجيا الأساسي. مئات microwells لكل سنتيمتر مربع من مساحة سطح الثقافة بدورها ضمان مستويات إنتاج مرتفعة للغاية يمكن تحقيقها من خلال عملية مكثفة nonlabor مباشرة. وبالتالي فإننا نتوقع أن هذا البروتوكول سوف يكون مفيدا على نطاق واسع للباحثين في مجال كروي الورم.

قد بسهولة أن تتولد الأجسام الشبه الكروية من خطوط الورم متعددة من أصول مختلفة واستخراج التشريحية في الثقافة الايقاف. الشكل 3 يوضح التحكم في حجم متسقة يمكن الحصول عليها عن طريق هذا الأسلوب، مع السكان كروي موحد للغاية تحت كل حالة. الخلافات خط واضح في السلوك واضحة أيضا، مع خلايا سرطان القولون HT29 وTE6 خلايا سرطان المريء تشكيل الأجسام الشبه الكروية المكتظ مع حدود محددة بشكل حاد، في حين أعطى الخلايا السرطانية LNCaP البروستاتا تؤدي إلى الكروية أقل تماسكا مع حدود غير منتظمة (انظر مناقشة لأسباب ممكن ). أدى القوى الداخلية أقوى في المجاميع أكثر تماسكا أيضا في انهيار إلى شكل أكثر توازنا حتى حين لا يزال في microwells التي تشكلت، في حين أن المجاميع LNCaP، لا سيما على حجم أكبر والاحتفاظ بها بشكل واضح هندسة مربع هرمي لل microwells. العلاقة بين أرقام خلية الإدخال وفيز<html> سوف حجم كال من كروي الناتجة تعتمد على عدد من المتغيرات. وربما يتم تخفيض كميات النظرية على أساس المنتج من حجم لكل خلية وعدد الخلايا التي تستخدمها فقدان الخلية، والتي بدورها قد تشمل فقدان الخلايا خلال مرحلة وحيدة الخلية تعليق، فضلا عن فقدان من المجاميع الصغيرة بشكل مفرط بسبب عدم كفاية أعداد الدول المجاورة، ومن المجاميع الكبيرة بشكل مفرط بسبب نقل القيود ونخر في قلب. كما تتأثر بأي حجم الانتشار التي قد تحدث أثناء عملية التجميع. كما سوف تختلف هذه المعايير من خط الخلية إلى خلية خط، إذا رغبت الكروية ذات الأبعاد المادية محددة يجب تحديد العدد الصحيح من الخلايا لإدخال تجريبيا. كما تقريب الأولى، ومن المتوقع أن يزيد مع الجذر التكعيبي لعدد من الخلايا أدرجت قطر كروي - على سبيل المثال بزيادة 8 أضعاف في عدد الخلايا ينبغي أن يؤدي إلى مضاعفة قطر كروي. <html> _content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي الإنتاج كروي. ويتكون النظام من microwell مجموعة من معبأة بإحكام مربع هرمي microwells (625 سم 2 في ل400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ حجم م)، في الخلايا التي قد تكون بالطرد المركزي. يتم إحضارها الخلايا معا عن طريق الجدران الجانبية المنحدرة، ويتم التحكم في حجم كروي الناجم عن كثافة متفاوتة من تعليق الخلية المستخدمة. 50665fig2highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. تجميع خلايا عنقودية في الأجسام الشبه الكروية. وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سبعمائة HT29 خلايا لكل منهما. مباشرة بعد الطرد المركزي (A)، وتتجمع خلايا فضفاضة في الجزء السفلي من كل microwell. لاحظ أن مجموعات ويقابل بشكل موحد نحو أسفل اليمين في هذه الحالة. هذا مقبول بشرط تظل أحجام كتلة متناسقة عبر صفيف. إذا رأيت اختلافات حجم الكتلة كبيرا من جانب واحد من مجموعة إلى أخرى، انظر ملاحظة في الخطوة 3.5. بعد حضانة لمدة 24 ساعة (B)، تسببت قوات لاصقة بين الخلايا مجموعات لتجميع وتشكيل الأجسام الشبه الكروية متماسكة، والتي قد ثم يتم استخراج (C). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> ص /&gt; الشكل 3. الأجسام الشبه الكروية ولدت في لوحات microwell. وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من سبعمائة (A، C، E) أو ألف وخمسمائة (B، D، F) خلايا سرطان القولون HT29 (A، B)، LNCaP خلايا سرطان البروستاتا (C، D) أو TE6 خلايا سرطان المريء (E، F). ملاحظة اتساق الكروية ضمن إعداد، وأيضا الاختلاف بين خطوط الخلايا - ولا سيما المجاميع LNCaP فضفاض بالمقارنة مع معبأة أكثر كثافة HT29 والخلايا TE6. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> تنسيق Microwell </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> عرض Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Microwells لكل سم 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Microwells لكل بئر </td><td> 1،200 </td><td> 4،700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> الخلايا الحد الأدنى لكل microwell * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> خلايا الأقصى في microwell * </td><td> 2،000 </td><td> 2،000 </td><td> 10،000 </td></tr><tr><td> الحد الأدنى خلايا لكل بئر * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 × 10 5 </td></tr><tr><td> خلايا أقصى لكل بئر * </td><td> 2.4 × 10 6 </td><td> 9.4 × 10 6 </td><td> 3 × 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70٪ حجم الإيثانول (مل) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - الشطف حجم الحل (مل) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - حجم متوسط ​​التحميل المسبق (مل) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - حجم التحميل الخليوي (مل) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * أرقام من الخلايا في microwell ليست سوى تقريب هذه القيمة كما سوف تختلف مع حجم الخلايا المحددة المستخدمة، وينبغي أن تحدد تجريبيا </td></tr></tbody></table> الجدول 1. AggreWell الخيارات والتعديلات البروتوكول.

ونحن نقدم بروتوكول لتوليد أعداد كبيرة (آلاف إلى مئات الآلاف) من حجم موحد وتكوين الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها الورم، وذلك باستخدام لوحات microwell متاحة تجاريا.

إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج أعداد كبيرة من الكريات الورمية ذات الحجم الموحد والمتحكم به. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير أطباق الآبار الدقيقة لتجميع الخلايا التي ستُشكل هذه الكريات. وفي الخطوة الثانية، يتم حصاد مزرعة من نوع الخلايا المطلوب، والتي توفر معلق الخلايا الذي يحدد حجم وتركيب الكريات العضوية (OIDs).يتم بعد ذلك طرد معلق الخلايا مركزياً داخل الآبار الدقيقة وتحضينه للسماح بتكوين السيرويدات. وبعد التحضين، تكون السيرويدات الناتجة متجانسة للغاية ويمكن جمعها أو استزراعها في الآبار الدقيقة التي تكونت فيها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية تكوين أعداد كبيرة جداً من التجمعات المتجانسة في وقت واحد.قد يجد الأشخاص الجدد في هذه الطريقة أن حجم العينات غير متسق. من المهم التأكد من توزيع معلق الخلايا بالتساوي عبر الطبق، وأن حاملات الأطبق المتأرجحة في جهاز الطرد المركزي المركزي تتحرك بحرية بحيث تكون القوة عمودية على السطح. للبدء، قم بتجهيز طبق agro well 400 معقم عن طريق إضافة 0.5 milliliters من محلول الشطف المحتوي على مادة خافضة للتوتر السطحي إلى كل بئر.يضمن استخدام المادة الخافضة للتوتر السطحي عدم تفاعل الخلايا مع سطح البئر الدقيق. ولتجنب حبس فقاعات الهواء داخل الآبار الدقيقة، أضف السائل على أحد الجوانب واتركه ينتشر عبر السطح بدلاً من إسقاطه عمودياً على السطح. وبعد إضافة المحلول إلى الآبار، أغلق الغطاء.تأكد من موازنة الدوار بشكل صحيح قبل طرد الصفائح مركزياً لمدة دقيقتين عند 2000 ×g. لإزالة الفقاعات باستخدام مجهر مقلوب منخفض التكبير، تحقق من خلو الآبار الدقيقة من الفقاعات. حضن الصفيحة لمدة 30 دقيقة على الأقل مع إغلاق الغطاء في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 °C. قم بسحب محلول الشطف من الآبار واغسل الصفيحة بالماء المعقم أو PBS مباشرة قبل الاستخدام.لا تسمح بجفاف الأطباق بعد الترميز. ستختلف تفاصيل تحضير الخلايا باختلاف نوع الخلايا المحددة التي يتم دراستها. ومع ذلك، فقد لاحظنا أن هذه الحالة فعالة لمجموعة واسعة من الخلايا، بما في ذلك السلالات التي ناقشناها هنا، بالإضافة إلى الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والعصبية، والخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات، والأرومات الليفية، والخلايا الظهارية الداخلية الأولية المفترضة، والخلايا السدوية. لتحضير الخلايا، ابدأ بقارورة T 75 من خلايا HT 29.قم بشفط وسط النمو من الدورق، وأضف ثلاثة ملليلتر من trypsin. حضن الخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 °C. أوقف عملية الهضم بواسطة trypsin عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من وسط النمو.انقل المتبقي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. ثم خذ من أنبوب الـ 15 ملليلتر عينة صغيرة لعد الخلايا. قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 200 ×g بينما تستمر عملية الطرد المركزي.قم بعدّ الخلايا. بعد ذلك، قم بسحب مزيج وسط التريپسين واستبداله بوسط نمو جديد، بحجم يتم تحديده بناءً على كثافة الخلايا المطلوبة والتي تم حسابها مسبقاً كما هو موضح في البروتوكول النصي كخطوة اختيارية.مرر معلق الخلايا عبر مصفاة لإزالة أي تكتلات. يمكن توليد الكريات في مجموعة متنوعة من تركيبات الأوساط الغذائية، ومع ذلك، يجب إجراء التجارب الأولية باستخدام الوسط الذي تم استزراع الخلايا فيه. وللتمييز بين آثار الانتقال إلى نظام استزراع ثلاثي الأبعاد وآثار تغيير تركيب الوسط الغذائي، ابدأ بإضافة 0.4 milliliters من وسط النمو إلى كل بئر، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 2000 ×g. لإزالة الفقاعات، استخدم مجهراً مقلوباً بقوة تكبير منخفضة، وتأكد من خلو الآبار الدقيقة من الفقاعات.بعد ذلك، أضف 0.4 milliliters من معلق الخلايا بالكثافة المطلوبة إلى الآبار الدقيقة. ثم اخلط بلطف عن طريق السحب والدفع بالماصة دون إدخال فقاعات هواء إلى الآبار الدقيقة، مع التأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء البئر، وذلك للحصول على ستيرويدات متسقة.قم بطرد plate المركز لمدة خمس دقائق عند 200 ×g. يجب موازنة plate داخلياً وكذلك مقابل plate الأخرى بحيث يتم توزيع الوزن بالتساوي على كلا جانبي حامل plate. يضمن ذلك تسوية plate ذاتياً أثناء عملية الطرد المركزي، حتى لا تنشأ تيارات حمل تؤدي إلى توزيع غير متساوٍ للخلايا عبر micro wells.باستخدام مجهر مقلوب، تحقق من تكتل الخلايا داخل الآبار الدقيقة ومن توزيعها بشكل متساوٍ عبر البئر قبل تحضين الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. راقب عملية تكوين الكرويات الخلوية باستخدام مجهر مقلوب. ستشكل بعض الخطوط الخلوية كرويات مدمجة خلال 24 ساعة.وقد يستغرق البعض وقتاً أطول. يظهر هنا التدرج من العنقود إلى التجمع في خلايا HT 29. الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو إخراج الستيرويدات دون المساس بالبنى. لاستخراج الستيرويدات من الآبار الدقيقة، قم بعملية السحب والدفع بالممصّة بلطف شديد للسماح للكرويات بالخروج من الآبار الدقيقة.بعد ذلك، قم بإمالة الطبق لسحب خليط الوسط والستيرويد. استخدم رؤوس ماصات ذات فتحة واسعة للستيرويدات ذات الحجم الأكبر لتجنب تكسير الستيرويد. بعد استعادة الستيرويد من الآبار الدقيقة، انقله إلى مزرعة التعليق عن طريق دفعه بلطف باستخدام الماصة.بدلاً من ذلك، يمكن الحفاظ على الورود الشديدة في حالة تشنج من خلال استبدال الوسط. تعتمد المدة على الحجم الأولي ومعدل النمو، وهو ما يحدد الوقت الذي تتجاوز فيه أحجامها الآبار الدقيقة. وبذلك، تم تشكيل الآبار لاستبدال الوسط دون فقدان الستيرويدات.قم بشفط الوسط عند حافة البئر. وباستخدام ماصة باستور، أنزل الطرف ببطء حتى يبدأ في سحب السائل من السطح المقعر، وتتبع السطح المقعر أثناء انخفاضه. ثم أضف وسطاً جديداً على جدار البئر في نفس الموضع.عند إضافة الوسط الغذائي الطازج، تذكر الضغط على الماصة برفق مع إبقاء الطرف ملاصقاً لجدار البئر لتجنب تعريض خلايا PHE في الآبار الصغيرة للاضطراب. قد يُفقد القليل من الستيرويد، ومع ذلك، إذا تم سحب الوسط واستبداله دائماً في الموضع نفسه، فسيظل هذا العدد ضئيلاً.بالمقارنة مع الأعداد الكبيرة في البئر، يمكن استخلاص الستيرويدات من خطوط أورام متعددة ذات أصول تشريحية مختلفة بسهولة في معلق. ويتم هنا استعراض التحكم المتسق في الحجم الذي يمكن تحقيقه عبر هذه الطريقة باستخدام مجموعات ستيروئيدية عالية التجانس، تحت كل حالة تم تشكيلها من 700 أو 1, 500 خلية.تظهر أيضاً اختلافات واضحة في السلوك بين الخطوط الخلوية، حيث تشكل خلايا سرطان القولون HT 29 وخلايا سرطان المريء TE 6 كرويات متراصة بكثافة ذات حدود محددة بوضوح. وعلى العكس من ذلك، تعطي خلايا سرطان البروستاتا lin cap كرويات أقل تماسكاً ذات حدود غير منتظمة. كما أدت القوى الداخلية القوية في التجمعات الأكثر تماسكاً إلى الانهيار لشكل أكثر تماثلاً، حتى أثناء وجودها في الآبار الدقيقة التي تشكلت فيها.ومع ذلك، فإن تجمعات سدادات الخطوط، خاصة في الأحجام الأكبر، تحتفظ بشكل مرئي بالهندسة المربعة للمجاوزات المعدنية الخاصة بالآبار الدقيقة. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة واحدة تقريبًا، بالإضافة إلى فترة الحضانة المطلوبة لالتصاق الخلايا وإفراز السوائل. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر ضمان خلو الآبار الدقيقة من الفقاعات قبل إضافة الخلايا.

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

يصف هذا البروتوكول نظام زرع الخلايا باستخدام كرويات معدلة وراثيا وقابلة للحقن. يتم زراعة كرويات الخلايا على ألواح مزرعة منقوشة وتستعيد بعد إدخال الجينات باستخدام النانو متعدد النماذج. يسهل هذا النظام التعبير الجيني المعدل لفترات طويلة من الخلايا المزروعة في المضيفة مع الحفاظ على الوظيفة الفطرية للخلايا.

الجينات ترنسفكأيشن نحو خلايا كروي على لوحات Micropatterned الثقافة لالمعدلة وراثيا زرع الخلايا

يتم تقديم بروتوكول للطباعة الروبوتية لكرويات الخلايا السرطانية بتنسيق لوحة عالية الإنتاجية 96 بئرا باستخدام نظام مائي ثنائي الطور.

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

يعد تحديد أهداف الأدوية الجديدة التي تنتقل من الاختبارات قبل السريرية إلى التجارب البشرية أولوية علمية. تحقيقا لهذه الغاية ، نصف هنا نهج الجينوم الوظيفي لفحص تأثير استنفاد الجينات على كرويات خط الخلايا السرطانية ، والتي تصمم بشكل أكثر ملاءمة السرطانات البشرية في الجسم الحي.

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

هنا ، نصف بروتوكولا سريعا ومرنا لتكوين كرويات الخلايا ثلاثية الأبعاد من خلال تجميع الخلايا. يمكن تكييف هذا بسهولة مع أنواع متعددة من الخلايا وهو مناسب للاستخدام في مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك هجرة الخلايا أو الغزو أو فحوصات anoikis ، ولتصوير وقياس تفاعلات مصفوفة الخلية.

على طريقة تجميع خلية فعالة ومرنة ل3D كروي الإنتاج

ويدخل هذا المخطوط وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. استخدام القوة المغناطيسية وخرز الصلب ومجموعة من خلال ثقب، شكلت ميكروويلس عدة مئات في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم.

حبة المزدوجة والصفيف المغناطيس لصب ميكروويلس مع الهندسات مقعرة متغير

عبر مجموعة واسعة من مؤشرات المرض، يجري النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا المخدرات المتقدمة وتنفذ في اكتشاف البرامج. النظام النموذجي الجديد الموصوفة هنا يوضح الورم ثلاثي الأبعاد كيف يمكن مثقف الماغنيسيوم وفرزهم في نظام القائم على لوحة الفائق 1536-جيدا للبحث عن أدوية جديدة لعلاج الأورام.

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

يصف البروتوكول الحالي تقنية لإنتاج كرويات الأنسجة على نطاق واسع وفعالة من حيث التكلفة باستخدام جهاز يشبه الطوابع المطبوعة ثلاثية الأبعاد.

توليد الأنسجة الكروية عبر جهاز يشبه الطوابع المطبوعة ثلاثية الأبعاد

توضح هذه المقالة طريقة موحدة لبناء كرويات الورم ثلاثية الأبعاد. كما تم وصف استراتيجية للمراقبة الكروية وتحليل التعلم العميق القائم على الصور باستخدام نظام التصوير الآلي.

توليد كرويات الورم 3D لدراسات تقييم المخدرات

هنا ، نقدم بروتوكولا يتيح التصنيع السريع والقوي والرخيص للكرويات السرطانية متبوعا بتغليف الهيدروجيل. إنه قابل للتطبيق على نطاق واسع لأنه لا يتطلب معدات متخصصة. سيكون مفيدا بشكل خاص لاستكشاف تفاعلات المصفوفة الكروية وبناء فسيولوجيا الأنسجة المختبرية أو نماذج علم الأمراض.

تصنيع وتغليف كروي للورم في الهلاميات المائية المصنوعة من البولي إيثيلين جلايكول لدراسة تفاعلات المصفوفة الكروية

هنا ، نصف طرق تكوين كروية متعددة الخلايا مختلفة لإجراء الفحص المجهري للخلايا الحية متعدد المعلمات للمتابعة. باستخدام المجهر التصويري مدى الحياة الفلوري (FLIM) ، والتألق الذاتي الخلوي ، والأصباغ الملطخة ، والجسيمات النانوية ، يتم إثبات نهج تحليل استقلاب الخلايا ، ونقص الأكسجة ، وموت الخلايا في السرطان الحي ثلاثي الأبعاد (3D) والأجسام الكروية المشتقة من الخلايا الجذعية.

الإنتاج والفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للخلايا الحية متعدد المعلمات (FLIM) للكرويات متعددة الخلايا

تقدم هذه الدراسة منهجية فعالة من حيث التكلفة وفعالة لتوليد هياكل الخلايا ثلاثية الأبعاد باستخدام نظام قائم على الطوابع لإنشاء الآبار الصغيرة في قوالب الاغاروز. يعزز النظام تكوين الكرات / العضيات الموحدة ، وبالتالي تحسين تفاعلات الخلية. يقلل هذا النهج من التباين التجريبي ويدعم التطبيقات في اختبار الأدوية وهندسة الأنسجة.

توليد الفيريات / العضيات ثلاثية الأبعاد من مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد باستخدام جهاز ختم جديد

اكتشف بروتوكولاً فعالاً لإنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية الموحدة الحجم باستخدام لوحات Microwell. تتيح هذه الطريقة للباحثين إجراء دراسات عالية الإنتاجية في علم الأحياء الخلوي وأورام السرطان.

إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام الشبه الكروية التي تسيطر عليها حجم الورم عن طريق لوحات Microwell

استكشف المزيد من الفيديوهات