الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام الفلورة لقياس استجابة التدفق التنفسي كمياً. أولاً، يتم وضع أجنة zebrafish في آبار طبق يحتوي على 96 بئراً. بعد ذلك، تُضاف مادة ركيزة فلورية ويتم تحفيز التدفق التنفسي باستخدام عامل كيميائي.

بعد ذلك، يتم قياس الفلورة النسبية باستخدام مقياس الفلورة. وفي النهاية، تُستخدم الفلورة لتوضيح إمكانية حدوث الدفقة التنفسية. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة كيفية تأثير التلاعبات التجريبية على الصحة العامة للمناعة الفطرية.

نستخدم هذه الطريقة هنا لتوفير رؤية متعمقة حول الدفقة التنفسية في أجنة أسماك الزيبرفيش، ولكن يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل أسماك الزيبرفيش البالغة، وخلايا الكلى، ومحضرات خلوية من أنواع أخرى من الأسماك. يتم إنماء الأجنة في أطباق بتري عميقة عند 28 درجة Celsius في ماء البيض حتى الوصول إلى المرحلة التطورية المطلوبة. يتم إزالة أي أجنة ميتة يومياً.

قم بسكب ماء البيض القديم بعناية واستبدله بماء بيض جديد يومياً. وفي يوم التجربة، قم بتحضير محلول عمل مخفف من الفلوريسين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 milliliter ملفوف بورق القصدير. قم أيضاً بتحضير محلول عمل بتركيز نهائي من PMA يبلغ 20 micrograms per milliliter.

بعد ذلك، قم بتحضير خمسة ملليمترات من كل محلول جرعات في أنابيب مخروطية سعة 15 ملليمتر كما هو موضح في النص المرفق. احتفظ بمحاليل الجرعات على الثلج، ثم قم بتشغيل قارئ الأطباق الدقيقة (Microplate reader) وتسخين مصدر الضوء لقياس الفلورية. قم بإعداد برنامج يحدد أطوال موجات الإثارة والانبعاث، وحساسية وضع البصريات، مع تضمين خطوة رج لمدة خمس ثوانٍ.

قبل البدء، قم بتجهيز المستلزمات التجريبية المكونة من أطباق تحتوي على أجنة مغلفة. صفيحة ميكروية سوداء ذات 96 بئراً، وماصة P 200 ورؤوس ماصات، ودلو ثلج يحتوي على الكواشف التي تحتوي على الفلوريسين. ماصة P 200 متعددة القنوات، وخزانان معقمان، ورق ألومنيوم، ومقص.

قم الآن بقص طرف الماصة بحيث يمكن للأجنة أو الكلى المرور من خلال الفتحة. اضبط الماصة P 200 على 100 microliters وانقل جنينًا واحدًا مع ماء البيض إلى العدد المطلوب من آبار لوحة ميكروية سوداء ذات 96 بئرًا. والآن صب محلول الجرعات في خزان معقم سعة 25 milliliter باستخدام ماصة P 200 متعددة القنوات.

أضف 100 µL من محلول جرعة H 2D CFDA في عمود واحد من صفيحة ميكروية ذات 96 بئراً، وكرر العملية لنصف عينات الأجنة الضابطة ونصف عينات الأجنة التي خضعت للتلاعب التجريبي. صب محلول الجرعة المحتوي على PMA في خزان معقم جديد سعة 25 mL.

ثم قم بتوزيع هذا المحلول الجرعي في الأعمدة المتبقية من الصفيحة الدقيقة ذات 96 بئراً. غطِ الصفيحة الدقيقة بورق الألمنيوم وضعها على جهاز هزاز لمدة 20 ثانية تقريباً. قم بتحضين الصفيحة الدقيقة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية وبسرعة 150 RPM في الأوقات التي لا يتم فيها إجراء القراءة.

اقرأ لوحة المعايرة الدقيقة بعد إضافة PMA. استمر في أخذ القياسات كل بضع دقائق للفترة الزمنية المطلوبة، أو قم بحضن لوحة المعايرة الدقيقة الملفوفة بورق القصدير عند 28 degrees Celsius حتى نقطة زمنية محددة. بعد ذلك، استخرج الأجنة من الآبار وقم بقتلها رحيمًا وفقًا لبروتوكول الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات.

بالإضافة إلى ذلك، تخلص من الطبق الدقيق والمواد الأخرى ذات الاستخدام الواحد في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة. حدد النقطة الزمنية التي ترغب في مقارنة الفلورة عندها. اطرح قيمة الفلورة المتوسطة لمجموعة التحكم غير المحفزة من قيم الفلورة الفردية لمجموعة التحكم المحفزة بواسطة PMA.

كرر هذه العملية للمجموعة التجريبية بوجود وبدون PMA. بعد ذلك، قم بتخزين قيم الفلورة المعيرة هذه في أعمدة: مجموعة الضبط مع PMA والمجموعة التجريبية مع PMA. بعد ذلك، احسب المتوسطات والانحرافات المعيارية لقيم الفلورة المعيرة لمجموعة الضبط مع PMA والمجموعة التجريبية مع PMA.

قارن قيم الفلورة المُطبعة باستخدام اختبار T غير المقترن لتحديد الدلالة الإحصائية. الآن، قم برسم المتوسطات لمجموعة الضبط مع PMA والمجموعة التجريبية مع PMA، مع وضع أشرطة الخطأ التي تعكس الانحرافات المعيارية المناسبة، وسجل مستوى الدلالة على الرسم البياني وفي وصف الشكل. تقارن هذه التجربة استجابة الانفجار التنفسي في أجنة سمك الزيبرا من النوع البري (wild type) ذات الخلفية AB عند 48 ساعة و72 ساعة بعد الإخصاب.

تم قياس الفلورة الخام بعد أربع ساعات من إضافة PMA في المجموعات التي تم تحفيزها بـ PMA. كانت قيم الفلورة الخام أعلى في مجتمع 72 HPF. وكما تشير قيم متوسطات الفلورة المحسوبة، فقد تم تطبيع القيم لمراعاة التباين في مستويات الفلورة الخلفية.

كشفت نتائج مقايسة الانفجار التنفسي هذه أن أجنة أسماك الزيبرفيش في عمر 72 HPF قادرة على إنتاج أنواع تفاعلية من الأكسجين بكميات أكبر بشكل ملحوظ، وبالتالي تظهر استجابة انفجار تنفسي أكثر قوة من أجنة 48 HPF بعد التحفيز باستخدام PMA. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفلورة لتقدير كمية إمكانات الانفجار التنفسي لأجنة أسماك الزيبرفيش. لا تنسَ أن العمل مع مسحوق PMA قد يكون خطيراً للغاية، لذا اتخذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء قناع للوجه أثناء وزن مسحوق PMA.