الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام التألق لتحديد استجابة انفجار الجهاز التنفسي. أولا ، قم بتحميل أجنة الزرد في آبار صفيحة 96 بئر. ثم أضف ركيزة فلورية وقم بتنشيط انفجار الجهاز التنفسي بعامل كيميائي.

ثم حدد كمية التألق النسبي باستخدام مقياس الفلور. في النهاية ، يتم استخدام التألق لإظهار إمكانية انفجار الجهاز التنفسي. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة كيفية تأثير التلاعب التجريبي على صحة المناعة الفطرية بشكل عام.

نستخدمه هنا لتقديم نظرة ثاقبة على الانفجار التنفسي لأجنة الزرد ، ولكن يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الزرد البالغ وخلايا الكلى والمستحضرات الخلوية من أنواع الأسماك الأخرى. قم بزراعة الأجنة في أطباق بتري عميقة عند 28 درجة مئوية في ماء البيض حتى مرحلة النمو المرغوبة. قم بإزالة أي أجنة ميتة يوميا.

صب ماء البيض القديم بعناية وتجديده بماء البيض الجديد يوميا. في يوم التجربة ، قم بعمل محلول عمل منخفض الفلورسين في أنبوب طرد مركزي دقيق ملفوف بورق الألمنيوم سعة 1.7 مل. قم أيضا بإعداد محلول عملي بمقدار 20 ميكروغرام لكل مليلتر من التركيز النهائي PMA.

ثم اصنع خمسة ملليلتر من كل محلول جرعات في أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر كما هو موضح في النص المصاحب. احتفظ بمحاليل الجرعات على الثلج أولا على قارئ Microplate وقم بتسخين مصدر الضوء لقياس التألق. قم بإعداد برنامج يوضح بالتفصيل الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث ، وحساسية موضع البصريات ، وقم أيضا بتضمين خطوة اهتزاز مدتها خمس ثوان.

قبل القصب ، قم بترتيب الإمدادات التجريبية للأطباق ذات الأجنة المطلية. صفيحة سوداء 96 بئر ماصة P 200 وتقلب دلو ثلج مع الفلورسين المحتوي على كواشف. ماصة متعددة القنوات P 200 ، خزانان معقمان ، رقائق الألومنيوم ، ومقص.

الآن قم بقص طرف الماصة بحيث يمكن للأجنة أو الكلى أن تتناسب مع الفتحة. اضبط ماصة P 200 على 100 ميكرولتر وانقل جنينا واحدا مع ماء البيض إلى أكبر عدد ممكن من آبار صفيحة دقيقة سوداء 96 بئر حسب الرغبة. الآن صب محلول الجرعات في خزان معقم سعة 25 ملليلتر مع ماصة P 200 متعددة القنوات.

أضف 100 ميكرولتر من محلول الجرعات H 2D CFDA في عمود واحد من 96. حسنا ، كرر الصفيحة الدقيقة لنصف عينات الأجنة الضابطة ونصف عينات الأجنة التي تم التلاعب بها تجريبيا. صب محلول الجرعات المحتوي على سلطة الحميدة الفلسطينية في خزان جديد معقم سعة 25 مل.

ثم قم بنقل محلول الجرعات هذا في الأعمدة المتبقية من الصفيحة الدقيقة 96 Well. غطي الصفيحة الدقيقة بورق الألمنيوم وضعيها على شاكر لمدة 20 ثانية تقريبا. عند 150 دورة في الدقيقة ، احتضن الصفيحة الدقيقة عند 28 درجة مئوية عندما لا تتم قراءتها.

اقرأ الصفيحة الدقيقة بعد إضافة PMA. استمر في أخذ القياسات كل بضع دقائق للفاصل الزمني المطلوب ، أو احتضان الصفيحة الدقيقة الملفوفة بورق الألمنيوم عند 28 درجة مئوية حتى نقطة زمنية محددة. بعد ذلك ، استرجع الأجنة من الآبار القتل الرحيم للأجنة وفقا لبروتوكول رعاية واستخدامها المؤسسي.

أيضا ، تخلص من الصفيحة الدقيقة والمواد الأخرى التي تستخدم لمرة واحدة في رسام النفايات الخطرة بيولوجيا. حدد النقطة الزمنية التي ترغب في مقارنة التألق فيها. اطرح متوسط قيمة التألق لمجموعة التحكم غير المستحثة من قيم مضان الإنفلونزا المستحثة ب PMA الفردية للمجموعة الضابطة.

كرر هذا للمجموعة التجريبية مع PMA وبدونه. ثم قم بتخزين قيم التألق الطبيعية هذه في أعمدة ، مجموعة التحكم بالإضافة إلى مجموعة PMA والمجموعة التجريبية بالإضافة إلى PMA. بعد ذلك ، احسب الوسائل والانحرافات المعيارية لقيم التألق الطبيعية للتحكم بالإضافة إلى مجموعة PMA والمجموعة التجريبية بالإضافة إلى PMA.

قارن قيم التألق الطبيعية باستخدام اختبار T غير المزدوج لتحديد الدلالة الإحصائية. الآن ، قم برسم بياني لوسائل مجموعة التحكم بالإضافة إلى مجموعة PMA والمجموعة التجريبية بالإضافة إلى PMA مع أشرطة الخطأ التي تعكس الانحرافات المعيارية المناسبة ، وسجل مستوى الدلالة على الرسم البياني وفي وسيلة إيضاح الشكل. تقارن هذه التجربة استجابة الانفجار التنفسي في أجنة أسماك الزرد البرية ذات الخلفية AB في 48 ساعة و 72 ساعة بعد الإخصاب.

تم قياس التألق الخام بعد أربع ساعات من إضافة PMA في المجموعات المستحثة PMA. كانت قيم التألق الخام أعلى في 72 HPF السكان. كما هو موضح في الوسائل المحسوبة ، يتم تطبيع قيم التألق لحساب التباين في مستويات الخلفية من التألق.

كشفت نتائج اختبار الانفجار التنفسي هذا أن أجنة أسماك الزرد HPF البالغ عددها 72 قادرة على إنتاج أنواع أكسجين أكثر تفاعلا بشكل ملحوظ ، وبالتالي تكوين استجابة انفجار تنفسي أكثر قوة من 48 جنينا HPF بعد التحريض باستخدام PMA. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام التألق لتحديد إمكانات الانفجار التنفسي لأجنة الزرد. لا تنس أن العمل مع مسحوق PMA يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا استخدم الاحتياطات مثل ارتداء قناع الوجه أثناء وزن مسحوق PMA.