باستخدام نظام 3D تتبع الآلي لتسجيل الفردية وشولز من اسماك الزرد الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة أنماط الحركة ثلاثية الأبعاد لأسماك الزيبرا أو الحيوانات المائية الأخرى، وتحليل خصائصها الكينماتيكية والمكانية والاجتماعية. ويسمح ذلك بالكشف عن السلوكيات المتغيرة الناتجة عن الطفرات الجينية أو العوامل الكيميائية والبيئية. يتم تحقيق ذلك من خلال معايرة النظام أولاً، وهو ما يعمل أيضاً على تصحيح التشوه الكبير في الصورة الناتج عن الانكسار.

تتمثل الخطوة الثانية في تسجيل إطارات الفيديو بدقة زمنية عالية نسبيًا من زاويتين مختلفتين على الأقل في وقت واحد. بعد ذلك، يقوم البرنامج بإعادة بناء مسارات الأسماك. وتُطبق خوارزميات متقدمة لتقليل تأثير الضوضاء واستنتاج موقع السمكة عند حدوث حجب أو تكتل.

تتمثل الخطوة النهائية في تحليل البيانات وإجراء التحليل الإحصائي لتسارع السرعة، وزاوية الدوران، والتوزيع الأفقي والرأسي في وعاء الملاحظة، والمسافات بين الأفراد، وغيرها من المعايير ذات الصلة. وفي نهاية المطاف، يفيد التتبع ثلاثي الأبعاد المعاير عالي السرعة في دراسة القصور السلوكي في أسماك zebrafish الطافرة وتأثيرات الأدوية على مجموعة متنوعة من الأنظمة السلوكية. وبالنسبة لأغراض اكتشاف الأدوية، تكمن إحدى مزايا هذا النظام في أنه يسمح بدراسة سلوك الأسماك في أبعاد ثلاثية.

يعد هذا الأمر مهماً لأن الأسماك تتحرك بطبيعتها في الأبعاد الثلاثة، وعند تسجيل عدة أسماك في وقت واحد، يمكن أن يكون التسجيل ثنائي الأبعاد مضللاً للغاية عند استقصاء التكوينات المكانية للمجموعة. وهناك ميزة أخرى للنظام وهي أنه يصحح انكسار الضوء، والذي إذا تُرِك دون تصحيح، يمكن أن يؤدي إلى أخطاء قياس كبيرة في تكوينه الحالي. يتم وضع وعاء المراقبة الذي يحتوي على أسماك الزيبرا في غرفة المراقبة.

تحتوي الغرفة أيضاً على كاميرا، ومرآة معلقة بزاوية 45 درجة تقريباً فوق الحاوية، وقضبان إضاءة LED. وقبل البدء في التسجيل، يتم معايرة النظام لتحديد مواقع جدار الحاوية وسطح الماء وعامل القياس للإطارات المسجلة، وكذلك تصحيح الخطأ الناتج عن انكسار الضوء عند انتقاله من الماء إلى الهواء. وبمجرد اكتمال المعايرة، يجب إجراء تشغيل تجريبي باستخدام سمكة وهمية.

يجب إجراء إعادة المعايرة إذا كانت مواضع المرآة أو الكاميرا غير دقيقة أو إذا كانت هناك مشكلات في التتبع. لبدء جلسة تسجيل، ضع حاوية الملاحظة المملوءة بالماء حتى العلامات في غرفة الملاحظة. يجب إدخال أرجل الحاوية في فتحات المحاذاة.

قم بتوجيه الحاويات بحيث تكون الجدران شبه الشفافة أو المعتمة مواجهة للجانب البعيد ولليمين كما تظهر من منظور الكاميرا. بعد ذلك، قم بتشغيل الأضواء في المقصورة، ثم ضع الأسماك في الحاوية وأغلق الستائر. افتح وحدة التسجيل وستظهر على الشاشة صورة للمنظر الأمامي والعلوي للحاوية.

في البداية، قد لا تكون الصورة المكتسبة مثالية، وبالتالي قد تحتاج إلى بعض الضبط للحصول على تباين كافٍ بين السمكة والخلفية. لضبط الصورة، اختر التحكم في الكاميرا (camera control)، ثم في نافذة الإعدادات العامة التي تفتح، قم بإلغاء تحديد المربعات الموضحة هنا، ثم اضبط الغالق (shutter) والكسب (gain) بحيث لا تكون الصورة مفرطة التعرض. بعد ذلك، ومن الجانب الأيسر لنافذة التحكم في الكاميرا، اختر توازن اللون الأبيض (white balance color)، وفي النافذة الجديدة، قم بإلغاء تحديد مربع التلقائي (auto) واضبط قيم اللونين الأحمر والأزرق للحصول على أفضل تباين لوني في كل من العرض الأمامي والعلوي.

قد يلزم إجراء تعديلات متعددة بعد اكتمال عمليات الضبط. من القائمة الرئيسية لوحدة التسجيل، اختر موقع البيانات لإنشاء مجلد أو اختياره. يجب أن يكون لكل تسجيل مجلده الخاص، والذي يجب أن يكون مجلداً فرعياً من مجلد التجربة.

اضغط الآن على بدء التسجيل وأدخل عدداً صحيحاً لمدّة التسجيل بالدقائق، ثم اضغط موافق لتبدأ جلسة التسجيل التجريبية. وبمجرد اكتمال التسجيلات، قم بنسخ ولصق المجلدات الفرعية لبيانات حاوية الحيوان وبيانات المراسلات من مجلد المعايرة إلى المجلدات التي تم إنشاؤها مسبقاً أثناء التسجيل؛ لبدء عملية إعادة بناء المسار، افتح وحدة التتبع (trajectory module) في البرنامج، ثم اضغط على موقع البيانات (data location) لاختيار المجلد الذي تم إنشاؤه بواسطة وحدة التسجيل.

بعد ذلك، اضغط على زر إعداد النظام (system setup) لفتح نافذة المعلمات أولاً، ثم اضبط عتبات اللون للعرض السفلي للنهاية العلوية. وتعتبر القيمة 1000 قيمة بدائية جيدة. بعد ذلك، اختر عتبات الحجم للعرض السفلي للنهاية العلوية.

يُعد الرقم 10 حجماً ابتددائياً مناسباً لسمكة الزيبرا متوسطة الحجم، أو يمكن استخدام 20 للسمكة الكبيرة و5 للسمكة الصغيرة. وكلما ارتفعت هذه العتبات، قل احتمال التقاط البرنامج للضوضاء. ومع ذلك، فقد لا يتمكن البرنامج من اكتشاف السمكة إذا كانت القيمة مرتفعة للغاية.

قد يصبح من الضروري إعادة ضبط هذه العتبات لاحقاً في التجربة. بالنسبة لعتبة الحجم العليا، فعادة ما تكون القيمة 3000 كافية. وبالنسبة للطول النوعي، احتفظ بالقيمة المحددة مسبقاً وهي 220.

يشير عدد الأسماك إلى عدد الأسماك الموجودة في خزان المراقبة. ويشير الحد الأقصى لعدد النقاط إلى إجمالي عدد الإطارات، قم بتسجيل أو تذكر هذا الرقم ثم اضغط موافق. بعد ذلك، اختر الحصول على الخلفية.

ستطلب النافذة التالية ملء حقلين: "من" و "إلى". بعد تحميل الخلفية، قم بتعديل المربعات الحمراء الثلاثة باستخدام الماوس، حيث تحدد هذه المربعات المناطق التي يبحث فيها البرنامج عن الأسماك. قم بتصغير المربع الموجود على اليسار.

بما أن العرض الجانبي يُستخدم للمعايرة فقط، اضغط الآن على زر بدء توليد المسارات وسيبدأ إعادة بناء المسار. من الناحية المثالية، يجب وضع العلامة على صورة السمكة؛ وفي حال تم وضعها بشكل غير صحيح في كثير من الأحيان، افتح نافذة المعلومات. نرى هنا حالة مثالية حيث تظهر الخطوط الخارجية للسمكة فقط.

في حالة وجود ضوضاء مفرطة، اضغط على إيقاف (stop) في القائمة الرئيسية واختر عتبات جديدة للون والحجم. كما يجب التحقق مما إذا كان يمكن تقليل المربعات الحمراء قليلاً. على سبيل المثال، في الأعلى، لاستبعاد الضوضاء الناتجة عن حركات المياه، راقب المسار على الشاشة ثلاثية الأبعاد (3D).

من خلال النقر بزر الماوس الأيمن، يمكن للباحث الاختيار بين تدوير أو إزاحة التكوين ثلاثي الأبعاد. لبدء معالجة البيانات، افتح وحدة معالجة البيانات، واختَر project من شريط الأدوات، ثم من القائمة المنسدلة، اختَر new وأدخل اسم التجربة. بعد ذلك، اختَر edit project.

بعد ذلك، قم بالإضافة إلى المشروع، ثم أنشئ مجموعة جديدة وأدخل اسماً للمجموعة التجريبية. الآن، حدد المجموعة التجريبية في النافذة اليمنى. لاحظ أن شريط الأدوات سيتغير.

حدد "edit group"، ثم "add to group"، وبعد ذلك "new measurements". سيؤدي هذا إلى فتح نافذة متصفح. بعد ذلك، افتح المجلد الذي تم إنشاؤه أثناء التسجيل، وحدد المجلد الفرعي "trajectories"، ثم اختر ملف "point smoothened".

في المثال المعروض هنا للمجموعة A، تم تحميل ستة ملفات وللمجموعة B أربعة ملفات. لبدء التحليل، اختر الملف الذي تمت تنعيمه (smoothened file) في النافذة اليمنى. ثم اختر معالجة البيانات (data processing) ونقاط النهاية ذات القيمة الواحدة (single value endpoints) من القائمة المنسدلة.

على سبيل المثال، اختر تجميد المدة (duration freezing). ستفتح نافذة لتحديد التجميد من حيث عتبة السرعة وعتبة المدة لتعريف نفسك بالبرنامج. جرب أمثلة أخرى مثل توزيع عمق مسافة السفر (travel distance depth distribution)، والذي يسمح بتحديد عدد مستويات العمق وتردد الاندفاع (burst frequency).

عند تحديد هذا الخيار، سيتم إجراء معالجة مجمعة باستخدام العتبة الافتراضية، حيث سيتم حساب حوالي 200 نقطة نهاية في هذا السياق. وتعني القيمة الافتراضية أنه قد تم تعيين المحددات؛ فعلى سبيل المثال، يتم حالياً حساب توزيع العمق لثلاثة مستويات من العمق، بينما يتم حساب التوزيع الزاوي لأربعة قطاعات.

بعد إنشاء المعلمات، ستفتح نافذة جديدة تطلب تحديد موقع واسم الملف المراد إنشاؤه. سيتم حفظ هذه الملفات بصيغة CSV ويمكن استيرادها إلى برمجيات أخرى. هنا، يوضح الشكل A إطاراً مثالياً نموذجياً لمجموعة التحكم.

سمك الزيبرا، بينما يظهر الشكل B إطاراً نموذجياً لسمك الزيبرا المعالج بـ MK 801، وكلاهما سُجلا خلال جلسة صباحية. يُلاحظ أن سمك الزيبرا في مجموعة الضبط كان قريباً من القاع ومتقارباً من بعضه البعض. وفي المقابل، كان سمك الزيبرا المعالج بـ MK 801 قريباً من السطح وسبح على مسافة كبيرة من بعضه البعض.

يُعرض هنا مساران تمثيليان لسمك الزيبرا في المجموعة الضابطة وسمك الزيبرا المعالج بـ 10 micromolar من MK 801 خلال جلسة صباحية وجلسة مسائية. وفي هذا الشكل، يتم عرض متوسط المسافات الاجتماعية للمجموعات الضابطة والأسماك المعالجة بـ 10 micromolar من MK 801 لكلا الجلستين، كما تُعرض هنا الخطوط الزمنية لمتوسط المسافات بين الأفراد لكلا المجموعتين.

نرى هنا في الشكل A توزيع سمك الزيبرا على 10 مستويات عمق متساوية خلال الجلسة الصباحية، وفي B، التوزيع الخاص بالجلسة المسائية. ويظهر هنا التوزيع الزمني للمجموعات التجريبية عبر المناطق الشعاعية الأربع. يوضح الشكل المدرج مواقع هذه المناطق من المركز إلى المحيط، ونرى هنا التوزيع الزمني للمجموعات التجريبية عبر الأرباع الأربعة.

يوضح الشكل الداخلي موقع الأرباع. تمثل الخطوط المزدوجة الجدران البيضاء، بينما تمثل الخطوط المفردة الجدران الشفافة. تقع الكاميرا على يسار الشكل الداخلي، أي أنها الأقرب إلى الربعين الأول والرابع.

تشير النجمات السوداء إلى المقارنات بين المجموعات من جلسة الصباح، بينما تشير النجمات الرمادية إلى تلك الخاصة بجلسات بعد الظهر. وأخيراً، تظهر هنا مكونات X و Y و Z لمسافة التنقل لسمكة zebra fish خلال جلستي الصباح وبعد الظهر. تم عرض المتوسط والخطأ المعياري للمتوسط.

عند العمل باستخدام النظام، تذكر أن جودة البيانات تعتمد كلياً على جودة التسجيل، لذا تأكد من معايرة النظام جيداً ومن أن إعدادات الكاميرا مثالية. أما بقية الخطوات فهي سهلة، ومجرد مسألة تعود على الخطوات المختلفة.