ضربة قاضية الجينات على نطاق واسع في C. ايليجانس استخدام المكتبات تغذية الرنا المزدوج الجديلة لتوليد قوية لتخفيف من وظيفة الظواهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء شاشات تداخل الحمض النووي الريبي على نطاق واسع في أناقة C باستخدام مكتبة تغذية DS RNA البكتيرية لإسقاط التعبير الجيني. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة المستنسخة البكتيرية أولا من مكتبة DS RNA. في ظل ظروف النمو التي تمنع فقدان البلازميد ، ابدأ بتكرار كل لوحة مكتبة أولية ثم استخدام لوحة المكتبة المكررة جيدا 96 لتوليد سيقان مؤقتة من البكتيريا على ألواح أجار أومني.

تزرع البكتيريا من هذه الصفائح الشاملة بين عشية وضحاها في مزرعة سائلة ثم تنتقل لاحقا إلى سطح ألواح تغذية الديدان. يحمل كل استنساخ بكتيري من المكتبة بلازميد ترميز D-S-R-N-A فريد يستهدف جين C elgan واحد للضربة القاضية. الخطوة الثانية هي وضع الديدان المتزامنة على ألواح التغذية.

بعد ذلك ، تزرع الديدان لعدة أيام في غرفة رطبة عند 20 درجة مئوية. عندما تتغذى الديدان على البكتيريا ، يتم إطلاق الحمض النووي الريبي DS المستحث في أمعاء حيث ينتشر بعد ذلك إلى الأنسجة المحيطة لإحداث تأثيرات ضربة قاضية جهازية. الخطوة الأخيرة هي فحص التي يتم تغذيتها بحثا عن تأثيرات النمط الظاهري الناجمة عن الضربة القاضية الخاصة بالجين.

تستخدم هذه المقايسات المظهرية لتحديد الجينات المهمة للعملية البيولوجية قيد الدراسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الحقن المجهري للحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في الغدد التناسلية الدودية هي أنها عالية الإنتاجية. باستخدام مكتبات التغذية ، يمكننا فحص الوظيفة البيولوجية لجميع جينات الجين البحري تقريبا في غضون أسابيع فقط.

كافحت العديد من المختبرات مع هذا النهج ضربة قاضية لأن معظم الجينات وأناقة C كافية لهافلو. وهكذا يجب أن تقلل ضربة قاضية من الحمض النووي الريبي من التعبير الجيني بأكثر من 50٪ لإنتاج فقدان الأنماط الظاهرية للوظيفة. لضمان ضربة قاضية قوية للجينات ، من الأهمية بمكان أن تعبر جميع البكتيريا التي يتم تغذيتها للديدان عن بلازميد الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل.

لبدء إجراء تحديد فقدان البلازميد ، قم بإزالة عينة صغيرة من البكتيريا كما هو موضح في كل خطوة ذات صلة وأضفها إلى 450 ميكرولتر من الماء المعقم. استخدم 100 ميكرولتر من هذه العينة المخففة لإنشاء المزيد من التخفيفات التسلسلية باستخدام الماء المعقم. امزج المحاليل جيدا بين التخفيفات.

انشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح LB و LB AMP واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي ، وحدد صفيحة LB التي تحتوي على ما بين 100 و 500 مستعمرة بكتيرية. احسب عدد المستعمرات على هذه اللوحة وعلى لوحة أمبير lb المقابلة التي تحتوي على نفس تخفيف البكتيريا. حدد فقدان البلازميد باستخدام هذه المعادلة.

يتم حساب النسبة المئوية للبكتيريا التي لا تحتوي على البلازميد عن طريق طرح عدد المستعمرات الموجودة على لوحة LB أمبير من عدد المستعمرات الموجودة على لوحة LB ، والقسمة على عدد المستعمرات الموجودة على صفيحة LB والضرب في 100 يتم منع فقدان البلازميد عن طريق نمو البكتيريا بتركيزات عالية من السيلين الكربوني من أجل ضربة قاضية فعالة. تحقق من فقدان البلازميد قبل إطعام واستمر فقط إذا كان فقدان البلازميد أقل من 15٪ ابدأ هذا الإجراء عن طريق إزالة لوحات المكتبة المكررة من الفريزر سالب 80 درجة مئوية. انزع ختم الرقائق بينما لا تزال الثقافات مجمدة.

استبدل الغطاء البلاستيكي للألواح واضبط ألواح المكتبة المكررة على سطح مستو لتذوب في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة. تعقيم الشدق 96 دبوس النسخ المتماثل. ضعه في حمام الإيثانول ثم احرق الإيثانول.

طلاء المسامير باستخدام كعكة وموقد. اترك اللهب ينطفئ ثم كرر. يجب شطف دبابيس النسخ المتماثل النظيف بالماء المقطر ثم تعقيمها قبل كل استخدام.

ضع النسخ المتماثل المعقم في آبار اللوحة المكررة المذابة واستخدمها لتقليب الثقافات برفق. سوف تلتصق كميات صغيرة من الثقافة بدبابيس النسخ المتماثل. قم بإزالة النسخ المتماثل بعناية من آبار اللوحة المكررة وضعها برفق على سطح اللوحة الشاملة.

احرص على عدم اختراق سطح الأجار. اترك النسخ المتماثل على سطح اللوحة الشاملة لمدة ثلاث إلى أربع ثوان بحيث يتم نقل البكتيريا من دبابيس النسخ المتماثل إلى سطح الأجار. لمنع فقدان البلازميد على الوسائط الصلبة ، يحتوي الطعام على ملليغرامين لكل ملليلتر.

كربونيك سيلين. قم بإزالة المكرر والسماح للحجم الصغير من الثقافة البكتيرية بالامتصاص في أجار. بعد تكرار كلتا اللوحتين.

احتضان الألواح الشاملة المقلوبة لمدة 15 إلى 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في صباح اليوم التالي. يمكن استخدام هذه الألواح الشاملة إما لتلقيح 96 مزرعة سائلة جيدا أو تخزينها لمدة تصل إلى سبعة أيام عند أربع درجات مئوية. يتم تحضير البكتيريا لتغذية الديدان كمزارع سائلة باستخدام بكتيريا من ألواح omni باستخدام ماصة متكررة وطرف مركب سعة 50 مليلتر ، وتوزيع مليلتر واحد من وسائط نمو البكتيريا في كل ملليلتر.

بئر عميق من 96 صفيحة بئر تعقيم النسخ المتماثل ووضعه على سطح صفيحة شاملة تحتوي على مستعمرات بكتيرية ، مع التأكد من أن المسامير على اتصال مع كل من المستعمرات البكتيرية البالغ عددها 96. انقل النسخ المتماثل بعناية من سطح اللوحة الشاملة إلى لوحة البئر العميقة ، مع التأكد من أن المسامير لا تكشط جوانب الآبار العميقة حتى تغمر في وسط النمو. لطرد البكتيريا في وسط النمو.

حرك النسخ المتماثل ببطء في حركة مربعة بعد الجدار الداخلي للوحة البئر العميقة. احرص على عدم رش الآبار وتلوثها. لكل 96 بئر عميق بئر ثقافة لوحة يجب تضمين اثنين من عناصر التحكم.

البكتيريا التي تعبر عن DS RNA كعنصر تحكم إيجابي للضربة القاضية المتوقعة والنمط الظاهري والبكتيريا التي تحتوي على ناقل DS RNA الفارغ كعنصر تحكم سلبي. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، قم بإزالة مستعمرة واحدة معزولة جيدا من لوحة التحكم الإيجابية وتلقيح بئر فارغ في البئر العميق يسمى اللوحة. سجل موضع البئر الذي تم تطعيمه.

كرر للتحكم السلبي. رج ألواح البئر العميقة في وضع مسطح عند 650 دورة في الدقيقة على شاكر دقيق عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد حضانة الثقافات بين عشية وضحاها ، سيتم نقل البكتيريا من 96 لوحة بئر عميقة إلى 12.

يمكن نقل ألواح التغذية الجيدة أربعة آبار في المرة الواحدة. ضع أطراف الماصة على كل قناة ثالثة من ماصة متعددة القنوات مكونة من 12 قناة. قم بإزالة 150 ميكرولترا من المزرعة البكتيرية من لوحة البئر العميقة وقم بإخراجها على سطح أربعة آبار من لوحة تغذية 12 بئر.

من المهم عدم اختراق سطح الأجار أثناء النقل لأن الديدان سوف تختبئ ولا تتغذى على DS RNA الذي يعبر عن البكتيريا. بعد نقل كل مجموعة من أربعة آبار ، استبدل أطراف الماصة الأربعة بأربعة أطراف ماصة معقمة جديدة وقم بزرع الآبار الأربعة التالية من لوحة التغذية ، وقم بتخزين الألواح المصنفة في وضع مستقيم في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل حتى تتمكن البكتيريا من امتصاصها في الأجار. قبل نقل L ، تم القبض على يرقات C elgan على ألواح تغذية DS RNA لشاشة التغذية.

تحديد تركيز اليرقات التي تم ضبطها مسبقا L. امزج قارورة إرلينماير التي تحتوي على يرقات L واحدة تم القبض عليها لتوزيع. ثم قم بإزالة كمية 10 ميكرولتر وضعها بالتنقيط على لوحة NGM غير مقلدة يبلغ طولها ستة سنتيمترات.

في أربع إلى خمس قطرات أسفل وسط اللوحة. تأكد من طرد جميع الوسائط من الماصة. باستخدام نهاية طرف الماصة، انشر نقاط تعليق الدودة لتشكيل خط واحد مستمر من السائل يمتد على قطر اللوحة.

باستخدام مجهر تشريح ، قم بحساب جميع بدءا من أحد طرفي خط السائل وتستمر إلى الطرف الآخر قبل أن يمتص السائل في اللوحة وتشتت. قد يتطلب ذلك إعادة تركيز مستمرة لنطاق التشريح للتأكد من عدم تفويت أي. كرر إجراء العد هذا لثلاثة حصص منفصلة سعة 10 ميكرولتر لتحديد متوسط عدد الديدان لكل ميكرولتر من تعليق الدودة وتسجيل هذا الرقم مباشرة على قارورة إرلينماير.

لبدء شاشة التغذية ، استخدم تعليق اليرقات الموقوف L one والماء المعقم لتحضير محلول يحتوي على 2000 دودة لكل ملليلتر. ستتطلب كل لوحة تغذية بئر 12 120 ميكرولترا من معلق الدودة هذا ممزوجا جيدا لضمان التوزيع المتساوي للحيوانات ونقل إلى خزان معقم لسحب العينات. باستخدام الماصة متعددة القنوات التي تم إعدادها بأطراف في كل موضع ثالث، انقل 10 ميكرولترات من محلول الدودة مباشرة إلى العشب البكتيري لألواح التغذية.

احرص على عدم اختراق سطح الأجار لأن الديدان سوف تختبئ في الأجار ولا تتغذى على البكتيريا التي تعبر عن D-S-R-N-A. بعد نقل محلول الدودة إلى كل صفين من ألواح التغذية ، أعد مزج محلول الدودة في الخزان عن طريق تحريكه برفق بينما تستقر الديدان بسرعة ، وافحص بعض الآبار في وقت مبكر تحت نطاق التشريح للتأكد من أن كل بئر يحصل على 20 إلى 30 دودة. بمجرد أن تحتوي جميع ألواح التغذية على ديدان ، قم بتخزين الألواح في وضع مستقيم في صندوق مرطب في حاضنة 20 درجة مئوية في اليوم التالي بعد امتصاص معلق الدودة في اللوحة ، وقم بقلب الألواح والعودة إلى صندوق الترطيب عند 20 درجة مئوية.

يمكن ملاحظة الموجودة على هذه الصفائح بعد ثلاثة أيام للأنماط الظاهرية P صفر ثم مرة أخرى بعد ستة أيام للأنماط الظاهرية F1. تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا لاختبار أربعة جينات للبيض المقلد L 30 dumpy 17 و PAT 10 وعلى أربع بيضات L 30 وعلى أربعة يتم التعبير عنها في الجهاز العصبي. يتم التعبير عن بات 10 في عضلة جدار الجسم ويتم التعبير عن دمبي 17 في خلايا البشرة.

استخدام طفرات Erie one Lin 15 B في الشاشات بسبب حساسيتها المعززة للحمض النووي الريبي كعنصر تحكم سلبي. تم تغذية الديدان بالبكتيريا التي تحتوي على البلازميد الفارغ PL 44 40 الذي لا يعبر عن DS RNA كما هو متوقع. RIE one Lin 15 B التي تغذى على البكتيريا الموجودة في البلازميد الفارغ لم تظهر أي عيوب مورفولوجية أو سلوكية.

تظهر هذه الصورة تتحرك بحرية كما يتضح من وضعية جسمها الطبيعية. يشير السهم الأسود إلى موضع شاب بالغ. يشير السهم الأبيض إلى موضع مجموعة من البيض الموضوع.

يظهر السلوك الطبيعي للديدان في مقطع الفيديو هذا ، بيضة L 30 تشفر سجل تقويم الأناقة البحرية للوحدة الفرعية لبروتين G ، ألفا Q ، عندما تم تغذية يرقات L في مرحلة واحدة من Erie one Lin 15 B البكتيريا التي تعبر عن البيض L 30 DS RNA. نمت اليرقات لتصبح بالغة تظهر عيوبا واضحة في الحركة وسلوك وضع البيض. بعد ثلاثة أيام ، أصيبت 100٪ من التي تغذت على الحمض النووي الريبي DS ضد البيض L 30 بالشلل وغير قادرة على وضع البيض.

تظهر هذه الصورة أن جميع قد تبنت مظهرا صلبا نموذجيا للحيوانات المشلولة. يجب أيضا ملاحظة الغياب التام للبيض الموضوع على الطبق. يقوم Dumpy 17 بتشفير بروتين الكولاجين المطلوب لتكوين بشرة في البحر.

Elgan و Dumpy 17 طفرة فارغة أقصر وأكثر بدانة من البرية. في هذه التجربة ، لم يلاحظ أي عيوب مورفولوجية في P zero التي تتغذى على 17 D-S-R-N-A. ومع ذلك ، فإن 98٪ من F1 أظهرت كما هو موضح في هذا الشكل النمط الظاهري المغمور.

لاحظ أن البالغة في الحقل ، والتي تتميز إحداها بالسهم ، أقصر وأكثر بدانة من البالغ المميز بالسهم الأسود. في اللوحة أ ، يشير عدم وجود قصيرة وسمينة P صفر إلى أن وظيفة الجين 17 مطلوبة في مراحل اليرقات المبكرة لتشكل الجسم المناسب. يقوم بات 10 بتشفير بروتين تروبونين CA لجدار الجسم الذي يحتوي على أربعة زخارف يدوية EF تربط الكالسيوم.

لوحظ في هذه الدراسة أن 100٪ من Erie one Lin 15 B التي تتغذى على Pat 10 DS RNA أصيبت بالشلل في غضون ثلاثة أيام ولم تضع أي بيض مما يؤدي إلى نمط ظاهري قاتل. لاحظ أنه على الرغم من إصابة بالشلل ، إلا أنها لا تزال قادرة على تحريك عضلات رأسها للتغذية كما يتضح من إزالة البكتيريا بالقرب من الرأس المميزة بالسهم الموجود على أربعة ترميز ، وهو بروتين مجال متماثل معبرا عنه في الخلايا العصبية الحركية للحبل البطني وهو مطلوب للمدخلات المشبكية المناسبة. تم اختيار الاختيار على أربعة كجين اختبار في هذه الدراسة لأنه أثبت أنه مقاوم لاستراتيجيات تغذية الحمض النووي الريبي DS السابقة.

أظهرت نتائج هذه الدراسة أن 62٪ من التي تتغذى على أربعة DS RNA تعبر عن بكتيريا من إعداد المكتبة أظهرت عيوبا في سلوك الحركة مقارنة بالحيوانات البرية التي تعود بحرية في حركة جيبية عند دفعها على الرأس ، لا تعود الطفرات الفارغة الأربعة UNC ، بل تتقلص بإحكام مما يتسبب في مثنية ظهرية ، والتي غالبا ما تصبح متطرفة لدرجة أن رأس وذيل يلمسان الجسم في وضع ملفوف. يوضح هذا الجدول النسبة المئوية للحيوانات التي تظهر أنماطا ظاهرية فارغة عند إطعامها DS RNA مقابل كل من الجينات الأربعة التي تم اختبارها ، وتم فحص 100 لكل تجربة ضربة قاضية. توضح هذه النتائج أهمية الاحتفاظ بالبلازميد لنجاح DS RNA.

ملاحظة فقدان الأنماط الظاهرية الوظيفية القوية وعالية الاختراق لشاشات التداخل في جميع الأنسجة. عندما تعبر جميع البكتيريا التي تتغذى على الديدان عن الحمض النووي الريبي DS بمجرد إتقانها ، يمكن فحص مكتبة التغذية بأكملها بواسطة شخص واحد في حوالي شهرين. لتحسين الإنتاجية ، نختبر كل استنساخ بكتيري مرة واحدة فقط في شاشة التغذية.

ثم يتم إعادة اختبار أي جينات تم تحديدها في المرور الأول عبر المكتبة. في النسخ الثلاثية ، نصر على ملاحظة النمط الظاهري المطلوب في جميع عمليات إعادة الاختبار لتربيع الجين كنتيجة إيجابية. ثم يتم تنقية البلازميد من البكتيريا وتسلسله للتحقق من هوية الجين المشفر.

بمجرد تحديد الجين ، نطلب طفرة L إذا كان متاحا ونختبرها بحثا عن النمط الظاهري المطلوب قبل إجراء أي توصيف إضافي للجين.