تصور الآثار المترتبة على تجربة إيجابية في وقت مبكر، اللمس تحفيز، على مورفولوجيا شجيري ومتشابك الربط مع جولجي كوكس تلطيخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تقنيات صبغ G Cox بالذهب لتصور التغيرات المورفولوجية في الخلايا العصبية التي تلي التحفيز اللمسي في مرحلة مبكرة من الحياة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تقديم التحفيز اللمسي ثلاث مرات يومياً من اليوم الثالث بعد الولادة حتى اليوم 21 بعد الولادة. تتمثل الخطوة الثانية في تروية الحيوانات بمجرد وصولها إلى سن الاستقصاء وتخزين أدمغتها في محلول Goldy cos.

بعد ذلك، يتم تقطيع الأدمغة باستخدام Aome. والخطوة النهائية هي تشريب الأدمغة باستخدام تقنية التلوين المشترك GOGI. وفي النهاية، يُستخدم إجراء GOGI co لتصور العصبونات الفردية، مما يسمح بتحليل التغيرات المورفولوجية.

تكمن روعة تقنية Goy Cox في أنها تتيح لنا قياس بنية العصبونات كمياً وربط ذلك بالنتائج السلوكية. وتمتد آثار هذه التقنية لتشمل الاضطرابات النمائية، حيث ثبت أن التحفيز اللمسي فعال في التعافي السلوكي والتشريحي من هذه الاضطرابات. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية عميقة حول التشريح العصبي للفئران، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات نموذجية أخرى وأنسجة الدماغ البشري.

للمساعدة في تعميق فهمنا للدونة المعتمدة على الخبرة، يتم الحفاظ على الحيوانات في دورة ضوئية ومظلمة مدتها 12 ساعة مع إتاحة الوصول الحر إلى الطعام والماء بعد الولادة. يتم إيواء كل جرذ أنثى بشكل فردي مع صغارها. ولتجنب الضغوط الإضافية المرتبطة بالتعامل اليدوي، تتلقى الجراء تحفيزاً لمسياً بدءاً من اليوم الثالث بعد الولادة (P3).

بعد وزن الجراء قبل جلسة التحفيز اللمسي الصباحية، انقل الجراء في أقفاصهم المنزلية إلى غرفة اختبار منفصلة. ضع القفص المنزلي على وسادة تدفئة مضبوطة على 24 درجة Celsius. وعند الاستعداد للتحفيز اللمسي، انزع الأمهات من أقفاصهم المنزلية وضعهم في قفص مؤقت يحتوي على الغذاء والماء.

احتفظ بالأم والقفص المؤقت في غرفة التربية. بعد ذلك، استخدم لوحاً صلباً لتقسيم قفص الإيواء إلى نصفين. ثم قم بتوزيع نصف الجراء من كل بطن عشوائياً للخضوع للتحفيز اللمسي، بينما يعمل النصف الآخر كمجموعة ضابطة.

قم بتحديد الأرجل الخلفية والذيل باستخدام قلم تحديد دائم للتمييز بين المجموعات، وضع الجراء في مجموعة التحفيز اللمسي في جانب واحد من القفص وجراء المجموعة الضابطة في الجانب الآخر. اضبط المؤقت على 15 دقيقة باستخدام منفضة ريش ناعمة. قم بتنظيف جميع الجراء في مجموعة التحفيز اللمسي بالفرشاة في وقت واحد لمدة 15 دقيقة متواصلة.

عادةً ما تتجمع صغار الجرذان معاً وتبدو وكأنها تدخل في دورة نوم عميق، مما يجعل تحفيز جميع الصغار في وقت واحد أمراً سهلاً للغاية. ومع تقدم الصغار في العمر، يصبحون أكثر نشاطاً، حيث يبدأ بعضهم في المشي والاستكشاف. وأثناء الجلسة، قم بنقل أي صغار متشردين إلى المجموعة لضمان تلقي كل صغير تحفيزاً متساوياً.

بعد 15 دقيقة من التحفيز اللمسي، أعد الأم إلى القفص وانقل القفص مرة أخرى إلى غرفة التربية. تُكرر هذه العملية ثلاث مرات يومياً. ولمدة 19 يوماً بعد جلسة التحفيز اللمسي الأخيرة، يتم فطام الجراء من أمهاتها. تُوضع الجراء في أقفاص مع خمسة أو ستة حيوانات مفطومة أخرى من نفس الجنس، وتُترك الجرذان دون إزعاج تحت ظروف إيواء قياسية حتى تصل إلى عمر الدراسة.

تُجمع العينات عندما تصل الحيوانات إلى عمر 100 يوم. وبعد القتل الرحيم والتروية داخل القلب، يتم استخراج الدماغ، مع الحرص على إبقاء المخيخ سليمًا.

ضع الأدمغة في زجاجة Nalgene معتمة مملوءة بـ 20 milliliters من محلول Goldy Cox، حيث تُحفظ لمدة 14 يوماً. وبعد مرور 14 يوماً، استبدل المحلول بمحلول سكروز بتركيز 30%. احتفظ بالأدمغة في محلول السكروز لمدة تتراوح بين يومين إلى خمسة أيام قبل البدء بعملية التقطيع.

قم بتجفيف الدماغ بالتربيت قبل تثبيته على منصة التقطيع باستخدام غراء Sano الأكريليكي لمنع التمزق أو التقطيع غير المتساوي، مع التأكد من تثبيت الدماغ بالكامل بإحكام على المنصة. بعد ذلك، املأ خزان جهاز Vibram بمحلول sucrose بتركيز 6% حتى يغمر شفرة التقطيع. اضبط السرعة وسعة الاهتزاز لجهاز Vibram على القيمة خمسة.

قطّع الدماغ إلى مقاطع بسمك 200 micron وضع المقاطع على شريحة مجهرية مغطاة بـ 2% gelatinized. تأكد من إبقاء المقاطع رطبة أثناء عملية التقطيع حتى يتم جمع كافة المقاطع المطلوبة. اضغط المقاطع على الشرائح عن طريق تسليط الضغط باستخدام ورق ترشيح مبلل.

ضع الشرائح في حامل شرائح واحفظها في غرفة رطوبة لمدة 12 ساعة على الأقل، على ألا تتجاوز المدة أربعة أيام. لبدء إجراء الصبغ، قم بتسمية وتجهيز 12 طبق صبغ زجاجياً. أولاً، اغمر الشرائح في ماء مقطر لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، ضع الشرائح في هيدروكسيد الأمونيوم واحفظها في الظلام لمدة 30 دقيقة. وبعد دقيقة إضافية في الماء المقطر، ضع الشرائح في Kodak Fix لمدة 30 دقيقة مع الحماية من الضوء. ضع الشرائح في الماء المقطر مرة أخرى قبل تجفيفها في سلسلة من محاليل الكحول المتدرجة.

بعد غسلة الكحول الأخيرة، ضع الشرائح في محلول One Third لمدة 15 دقيقة. وأخيرًا، ضع الشرائح في Hemo D لمدة 15 دقيقة. وعندما تصبح جاهزة، استخدم Paramount لوضع أغطية الشرائح فوقها، واترك الشرائح لتجف في الهواء قبل فحصها باستخدام المجهر.

تظهر هنا صورة تمثيلية لعصبون جنيبي ميتالي (parametal neuron) في جرذ تلقى تحفيزاً لمسياً أثناء النمو، مصبوغاً بطريقة جولجي كوكس (Golgi Cox). وتوضح صورة مكبرة الأشواك التغصنية الموجود على التغصنات الطرفية. الصورة الفاتحة على اليسار تعود لجرذ من المجموعة الضابطة، بينما الصورة الداكنة تعود لجرذ تلقى تحفيزاً لمسياً.

يمثل هذا الرسم البياني متوسط تعقيد التغصنات القمية والقاعدية للعصبونات في منطقة CG الثلاثة من الجرذان البالغة التي تلقت تحفيزاً لمسياً أثناء النمو أو لم تتلقه. ومن خلال اتباع هذا الإجراء، نتمتع بميزة تكمن في أنه إذا أردنا طرح أسئلة إضافية، فإننا نكون قد صبغنا الدماغ بأكمله، وبالتالي يمكننا العودة واستخدام نفس أنسجة الدماغ للإجابة على تلك الأسئلة. ومن خلال تطوير هذه التقنيات، مهدنا الطريق للباحثين لاستكشاف فائدة التحفيز اللمسي كعلاج لإصابات الرأس أو غيرها من أشكال الإصابات العصبية بعد حدوثها.

مهدت هذه التقنية الطريق لباحثي علوم الأعصاب لاستكشاف إمكاناتها في علاج إصابات الدماغ والاضطرابات النمائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تزويد الجراء الملفوفة بتجربة إثراء عن طريق التحفيز اللمسي، بالإضافة إلى وسيلة تتيح تصور الخلايا العصبية والمشابك العصبية الفردية.